抗菌光动力治疗的作用机制及其在牙周炎治疗中应用的研究进展

刘旭旭, 舒萌萌, 王瑞凤, 刘 敏

（吉林大学口腔医院牙周科，吉林 长春 130021）

1900 年光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）的原理首次被报道，1904 年PDT 被应用于皮肤癌的临床治疗，并报道了细菌的光动力灭活现象。目前，PDT 作为癌症治疗的替代方法已应用于临床实践，例如光化性角化病和基底细胞癌的治疗［1］。PDT 应用于癌症治疗的主要原理是导致癌细胞的凋亡和坏死，从而破坏生长异常的活性组织。20 世纪90 年代初，有学者［2］研究发现：PDT也可以应用于细菌、真菌和病毒感染的治疗，被称为抗菌光动力治疗（antimicrobial photodynamic therapy，aPDT）。牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性炎症，因此aPDT 可以应用于牙周炎的治疗。近年来，许多学者对aPDT 的作用机制、不同类型的光源（激光器、发光二极管和气体发电灯等）和光敏剂（photosensitizer，PS）（亚甲基蓝、卟啉和姜黄素等）及aPDT 治疗牙周炎的效果等进行了大量研究，但目前国内外综述内容主要集中于aPDT 在全身疾病治疗中的作用机制及研究现状方面，其在牙周炎治疗中的作用及最新研究进展的相关综述国内尚未见报道。现将对aPDT 的作用机制及其在牙周炎治疗中应用的研究现状进行综述。

1 aPDT 的作用机制

aPDT 的作用机制是基于3 种要素的组合：PS、处于激发PS 光谱范围的光（通常从可见光到近红外光谱）和分子氧［3-4］。PS 具有稳定的电子配置，其设置为最低或基态水平。在一定波长下照射后，PS 吸收光能从基态提升到激发态，即电子重新定位到更高的能量轨道。该单重态不稳定，电子很容易失去多余的能量，并通过发射光（即荧光）或热量而返回基态。此外，电子自旋的变化也可以使分子转变为更长寿命的激发三重态PS（此过程称为“系统间交叉”）。三重态PS 通过2 种不同的途径与底物反应（Ⅰ型反应和Ⅱ型反应）。Ⅰ型反应主要是电子从三重态PS 转移到细胞内的有机底物上，产生自由基，在分子水平上与氧相互作用，并产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧化物、羟基自由基和过氧化氢，主要由类芬顿（Fenton-like） 反应形成。在Ⅱ型反应中，能量在激发的PS 和基态分子氧之间发生转移，产生单线态氧，该单线态氧可以与细胞中的大量分子相互作用而产生氧化产物。上述2 种类型反应发生的概率取决于所使用的PS 类型以及应用aPDT 的环境［5］。ROS 通过氧化作用攻击靶细胞结构（细胞膜、线粒体和核酸等），使其发生氧化损伤，而后通过细胞内一系列的级联反应引起细胞内生化功能改变，当氧化损伤累积超过一定阈值时可以杀伤细胞并导致细胞死亡［3，6］。

1.1 aPDT 的光源

目前，应用于aPDT 中激活PS 的可见光源可分为3 种：激光器，如掺杂氩、二极管或钕的激光器，掺杂钇、铝或石榴石［Nd∶YAG］ 激光器；发光二极管（light emitting diode，LED）；气体放电灯，如石英钨卤素灯或氙气放电灯。应用激光器的优势主要在于其发出激光的单色性及光谱稳定性而不是其他特性（相干性、平行光束传播和窄空间强度），因此容易耦合到单个光纤中并安装在不同的光传输设备上。LED 的主要优点为体积小、使用寿命长且引起热量较低。与激光器比较，LED的发射光谱略宽，成本更低［7］。气体放电灯的优势在于可以进行光谱过滤以匹配任何PS，但其不能有效地耦合到光纤束或液体光导中，且与激光和LED 比较，其热量较高［8］。对于在人体内进行aPDT 的任何临床应用，必须考虑由给定光源引起的发热。由于照射时间和所用的光源不同，所施加的能量剂量过大可能导致温度升高，从而可能导致组织损伤［9］。例如，用卤素灯照射牙齿45～60 s，可使牙本质温度升高约5℃，而温度升高5.5℃会对牙髓产生不利影响［10］。

总之，对于某一特定PS 的激活，其发射的光谱、光源强度及光传输方式（通过光纤传输或直接传输）比光源本身的类型（激光器、LED 或气体放电灯）更为重要。

1.2 aPDT 的PS

目前应用于牙周炎治疗的PS 根据其结构和来源分为合成染料、四吡咯结构和天然光敏剂。

1.2.1 合成染料 目前最常用的合成染料亚甲基蓝和甲苯胺蓝为吩噻嗪类染料，属于阳离子二代PS［11］。吩噻嗪类染料由具有环色侧基的三环π 系统组成，带有一个正电荷，并且单线态氧量子产率低于0.5，因此主要是由Ⅰ型反应起作用，在红色光谱（波长位于600～680 nm）中显示出较强的吸收性，由于较长波长的光可以更好地穿透组织，且具有阳离子电荷，对于革兰阳性菌和革兰阴性菌具有很高的亲和力，因此可以用于牙周炎的治疗。虽然吩噻嗪类染料有很好的抑菌作用，但是其会在短期内对口腔中正常组织细胞产生光毒性，并且具有致癌风险。

1.2.2 四吡咯类化合物 四吡咯类化合物是由4 个吡咯环通过亚甲基相连形成的具有18 个电子体系的杂环-大环化合物。四吡咯类化合物中的酞菁和卟啉常用于牙周炎的治疗。其中，锌酞菁对革兰阳性菌有较好的杀菌效果，对革兰阴性菌是否有效仍存在争议。但有研究［12］表明：当锌酞菁与多黏菌素联合使用时，对革兰阴性菌有一定效果。目前尚无关于酞菁应用于牙周炎治疗的临床研究报道。

卟啉是广泛存在于自然界及生物体内的内源性PS，波长为405 nm 蓝光激发卟啉的单态氧量子产率为0.5～0.8，因此主要由Ⅱ型反应起作用。细菌内源性卟啉是一种芳香族分子，是亚铁血红素在体内合成的前体，多数组织细胞及细菌都可合成亚铁血红素，故在体外仅用可见光照射就能成功灭活细菌［13］。众所周知，有些口腔细菌会在代谢过程中形成内源性卟啉，例如牙龈卟啉单胞菌（附着、凝集因子及组织破坏双重作用）、普氏杆菌（组织破坏作用）和产黑色素的放线菌聚合杆菌属（降低宿主抵抗力、骨组织破坏和分泌白细胞毒素等多种毒性作用）。但蓝光激发内源性卟啉的活性氧产量较高，其光敏反应强烈，在应用其治疗时常有明显疼痛感。

1.2.3 天然PS 天然PS 是从植物和其他生物体内提取的天然化合物，例如金丝桃素、核黄素、竹红菌素、姜黄素和二氢卟吩等。近年来，对天然PS 的研究主要局限于抗癌PDT，对aPDT 的研究较少，目前应用于牙周炎治疗的天然光敏剂为姜黄素和二氢卟吩。姜黄素是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取到的PS，最近的研究［14］表明：姜黄素对耐药菌株有一定的光灭活作用，此外姜黄素还具有抗氧化、抗炎和促进创面愈合的功能，因此姜黄素可以用于牙周炎的治疗。二氢卟吩（chlorine e6，Ce6） 是从天然叶绿素中提取的性能优良的PS，具有光动力反应能力强和不良反应少等优点，在红色光谱（波长约630 nm） 中显示出较强的吸收性，因此可以更好地穿透组织，应用于牙周炎的治疗。

2 aPDT 在牙周炎治疗中应用的研究进展

牙周炎是常见的慢性感染性疾病，可造成牙周软硬组织的破坏，菌斑生物膜是牙周炎的始动因子。菌斑生物膜形成过程中，大量细菌可在龈下牙面积累，早期的菌落为后期的菌落提供附着底物，因此，消除龈下菌斑生物膜是治疗牙周炎的首要治疗手段［15］。目前消除龈下菌斑生物膜的方法主要是机械清创，然而随着牙周袋深度的增加，由于牙齿解剖形态复杂（牙根深部凹陷和根分叉）、器械外形难以贴合牙面和临床医生经验不足等原因，很难有效清除龈下菌斑［16］。此外，牙周袋深度治疗能增加手术创伤和术后并发症（菌血症）的风险。对于晚期牙周炎和较深的牙周袋，机械清创不能取得很好的治疗效果，研究者提出应用抗生素可作为其辅助治疗［17］，然而长期应用抗生素易引起耐药菌株的出现和细菌耐药性增加，杀菌效果较差。最近的一项研究［18］显示：74.2%的慢性牙周炎患者表现出对一种或多种抗生素耐药，55.0%、43.3%、30.3%和26.5%的慢性牙周炎患者分别对强力霉素、阿莫西林、甲硝唑和克林霉素具有耐药性。此外，全身和局部应用抗生素作为牙周炎的辅助治疗有多种不良反应，例如过敏反应、胃肠道反应及肾损伤等。近年来，为了完善现有的抗菌措施，研究者尝试将aPDT 应用于牙周炎的治疗。

2.1 aPDT 应用于牙周炎的基础研究

已有研究［19］表明：在亚甲基蓝和甲苯胺蓝作为PS 的情况下，有些牙周病原菌对红色激光敏感，例如牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌等。有学者［20］认为：亚甲基蓝和甲苯胺蓝介导的aPDT 对处于浮游状态的牙周致病菌敏感性较强，但对从天然牙菌斑中提取的生物膜敏感性较差，可能与PS失活、生物膜中的细菌处于低生长状态、亚甲基蓝在生物膜中渗透性较差以及细菌可通过多重耐药泵排出亚甲基蓝有关。因此，近年来许多学者［21］尝试通过化学修饰来增强亚甲基蓝和甲苯胺蓝介导的aPDT 对生物膜的敏感性，例如新亚甲基蓝和二甲基 亚 甲 基 蓝 等。KLEPAC-CERAJ 等［22］使 用 聚 乳酸-羟基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］纳米颗粒作为亚甲基蓝的载体从而改善亚甲基蓝的给药方式，增强其对生物膜的敏感性。研究［23］显示：将亚甲基蓝和6-羧基蝶呤同时作为aPDT 的PS，两者可以互补波长吸收范围，提高多色辐射的使用效率，从而根除耐多药菌肺炎克雷伯菌的成熟生物膜。

由于亚甲基蓝和甲苯胺蓝等合成染料具有致癌风险并对口腔正常组织细胞产生光毒性，因此开始着重于细菌内源性卟啉的研究。细菌内源性卟啉介导的aPDT 对处于浮游状态的牙周致病菌具有很强的敏感性。YOSHIDA 等［24］和CIEPLIK 等［25］分别采用蓝光激发牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的内源性卟啉产生ROS，达到了很好的抑菌效果，但内源性卟啉作为PS 的aPDT 同样对生物膜状态的细菌敏感性较差。有学者［26］发现：aPDT 可以去除种植体周围炎相关生物膜的黏液层，但仍需使用进一步的方法完全去除被削弱或破坏的生物膜基质成分。CARRERA 等［27］研究了内源性卟啉介导的aPDT 对牙龈卟啉单胞菌和中间普氏菌的杀菌效果，结果显示：aPDT 对处于浮游状态的细菌杀菌效果较好，而对两者构成的生物膜杀菌效果较差。此外，牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌中内源性卟啉和亚铁血红素的含量受培养时间的影响较大，因此在进行内源性卟啉介导的aPDT 试验时，需要更多的标准化培养方案，以避免不同的培养条件下aPDT 目标PS—内源性卟啉的浓度差异过大［28］。

姜黄素和Ce6 作为aPDT 的PS 具有许多优势。其中姜黄素可以明显减少菌斑的发生风险，并对牙龈炎、牙周炎和种植体周围炎的治疗有一定的作用。有研究［29］显示：姜黄素能够杀死牙周炎的致病菌伴放线聚集杆菌，通过光灭活效应抑制耐药细菌菌株的生长，还可以通过抗炎作用促进牙周组织的恢复。但天然的姜黄素在生理pH 值条件下水溶性差，将姜黄素应用于临床仍需要进一步的研究［30］。Ce6 的组织穿透能力使其可以很好地清除位于牙周袋深处及根分叉处的细菌，因此有学者将Ce6 引入牙周炎的治疗。SUN 等［31］合成了含Ce6、香豆素6 和四氧化三铁（Fe3O4） 的多功能纳米粒子作为PS，该纳米粒子在630 nm 的红光激发下，对血链球菌、牙龈卟啉单胞菌和梭核杆菌有很好的抑制作用。

2.2 aPDT 应用于牙周炎的临床研究

在慢性牙周炎患者的治疗中，aPDT 可发挥一定的作用。BETSY 等［32］将90 例未经治疗的慢性牙周炎患者（男性39 例，女性51 例）随机分为实验组（aPDT 作为龈下刮治术和根面平整术的辅助治疗） 和对照组（仅使用龈下刮治术和根面平整术），结果表明：在短期的慢性牙周炎疗效维护中，aPDT 是龈下刮治和根面平整的有效辅助治疗手段。

对于侵袭性牙周炎的患者，aPDT 效果明显。CHITSAZI 等［33］对24 例临床诊断为侵袭性牙周炎的患者进行对照实验观察发现：aPDT 联合机械清创能有效抑制伴放线聚集杆菌的生长，并且患者的牙周袋探诊深度降低，探诊出血位点减少。MOREIRA 等［34］研 究 显 示：aPDT 作 为 根 面 平 整的辅助方法，在侵袭性牙周炎患者单根牙深牙周袋的治疗中，对减少探诊出血、改善菌斑指数和增强免疫力等方面均有益处。

对于种植体周围炎的患者，aPDT 联合机械清创具有同样治疗效果。研究［35］表明：aPDT 联合机械清创可减少探诊出血，降低牙周袋深度。另外CARCIR 等［36］通 过 临 床 试 验 发 现：aPDT 联 合 机械清创可以促进种植体与周围骨质的结合。但要确定aPDT 联合机械清创与其他治疗方式（应用抗生素等）的治疗效果的优势，仍需要进一步的临床试验观察。

与单独的机械治疗比较，辅助aPDT 在牙周炎患者减少探诊出血和降低探诊深度方面有更好的短期临床治疗效果。但aPDT 作为牙周炎辅助治疗的方法，其长期疗效如何仍缺乏数据支持［37］。对于伴有系统性疾病的牙周炎患者（糖尿病患者和自身免疫性疾病患者等），aPDT 联合机械清创的临床治疗效果如何，需要进一步的临床试验观察。

2.3 aPDT 抗性的研究

目前，对于应用aPDT 的细菌是否会产生耐药性的研究大多局限于处于浮游状态的细菌［38］。LAURO 等［39］的研究结果表明：用卟啉-聚赖氨酸共轭物作为PS 的伴放线聚集杆菌和消化链球菌在经过10 个传代之后，对抗生素和aPDT 的敏感性并未发生改变。TAVARES 等［40］用卟啉衍生物对费氏弧菌和大肠杆菌进行了10 个aPDT 循环后，也未发现其敏感性有明显变化。STREET 等［41］研究了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌耐药菌株（MSSA 和MSRA）在重复使用亚甲基蓝的情况下，是否会对aPDT 产生抗性，其中大肠杆菌经过11 个传代，MSSA 和MSRA 经过25 个传代后，对aPDT 的敏感性并未发生明显的变化。但是当细菌处于固着的生物膜状态时，产生抗药性的风险通常更高。考虑到生物膜感染是由多种微生物共同引起的，生物膜内的潜在抗性可以通过“水平基因转移”在不同物种间转移，使生物膜状态的细菌对抗生素的耐受性较处于浮游状态的细菌强1 000 倍。最新的研究［42］表明：处于生物膜状态的细菌在经过10 个aPDT 循环后，对抗生素和aPDT 的敏感性未发生改变。

另外，当细菌长时间持续暴露于低剂量的抗生素时，才会产生耐药性，而目前的实验设计大多是短时间的暴露，因此有学者认为应该将细菌长时间持续暴露于亚抗菌水平的aPDT 中来检测其耐药性。CASSIDY 等［43］检测了处于亚抗菌水平aPDT下金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对aPDT 和抗生素的敏感性，结果表明：将卟啉和亚甲基蓝作为PS 的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌暴露于亚抗菌水平的aPDT 72 h，细菌对抗生素和aPDT 的敏感性均未发生改变。

2.4 稀土掺杂的上转换纳米粒子（up-conversion nanoparticles，UCNPs）的应用

传统aPDT 中牙周炎致病菌大多通过紫外光或可见光照射达到最佳的激发状态，从而杀伤细菌，但由于紫外光和可见光的组织穿透深度较浅不足以达到牙周袋深处，无法取得良好的治疗效果。而近红外光（波长700～2 500 nm） 组织穿透能力强、无光毒性和光损伤等不良反应，但杀菌效果较差［44］。如果应用UCNPs 将近红外光转换为可见光和紫外光，可以突破传统aPDT 的局限性。

UCNPs 通过反斯托克斯发射过程，吸收长波长的低能量光子而发射出短波长的高能量光子，将近红外光转换为可见光和紫外光，从而激活PS［45］。此外，UCNPs 的光学特性稳定，具有发射带较窄、寿命较长和发射位置稳定等特点，更重要的是，应用于牙周炎治疗的激发光主要位于生物学的第一窗口（波长700～1 100 nm），不仅组织穿透能力较强，而且对组织损伤较小［46］。在PDT 中应用UCNPs 的主要原理：UCNPs 的发射峰与邻近的PS 吸收峰重合，UCNPs 作为PS 的能量给体实现能量传递，激活PS 产生ROS 杀伤肿瘤细胞。WANG 等［47］将Ce6 负载在聚合物包覆的UCNPs上，形成UCNP-Ce6 超分子复合物，在980 nm 近红外光照射下被间接激活产生ROS 杀死癌细胞，获得良好的治疗效果。

最近研究［48］表明：UCNPs 也可以应用于针对微 生 物 的aPDT。有 学 者［49］合 成 了 含UCNPs（NaYF4∶Mn/Yb/Er）、亚甲基蓝及CuS-壳聚糖的多功能纳米粒子。UCNPs 将980 nm 的近红外光转换为650～670 nm 的可见光激活亚甲基蓝，杀菌效果可达99%。ZHANG 等［50］首次将近红外光激发的UCNPs 引入牙周病的治疗，突破了在aPDT 中激发光穿透组织深度的限制，Ce6 与UCNPs 结合，形成一种新的PS，在近红外光的照射下，aPDT 对牙龈卟啉单胞菌等3 种细菌及其生物膜的作用明显增强。QI 等［51］的实验阐明了UCNPs@二氧化钛（TiO2） 的合成路线及其在近红外光激发的aPDT中的作用机制：在980 nm 的近红外光的激发下，UCNPs 将近红外光转化为紫外光，紫外光诱导TiO2壳层，电子从价带转移到导带，导致产生空穴-电子对，从而引发氧化还原反应生成活性氧导致细胞膜通透性改变和DNA 损伤，最终细菌死亡。

考虑到牙周感染总是位于牙周袋深处、根分叉和牙齿表面不规则区域［51］，如果近红外激发aPDT可以增加组织穿透深度，应用UCNPs 将近红外光转换为可见光和紫外光，将可能作为一个重要的方法来解决当前的瓶颈问题，在牙周疾病的治疗中具有重要的应用前景。

3 展 望

应用aPDT 治疗牙周病具有创伤小、速度快和杀菌能力强等特点，但仍处于开发和测试的试验阶段，为了达到aPDT 的最佳治疗效果，仍需要开发新的PS 和优化光传递系统，并进行进一步的临床研究。aPDT 对牙周炎致病菌有较强的敏感性，特别是在避免细菌产生耐药性及有效清除细菌方面，与机械清创和应用抗生素等治疗手段比较具有较强的优越性和较少的操作时间。因此，aPDT 是治疗牙周炎的最新方法，在牙周疾病的治疗中具有重要研究价值及应用前景。