低剂量电离辐射对STZ 诱导糖尿病模型大鼠海马神经元的影响

刘 飞, 梁 硕, 王栎萱, 秦丽晶, 郭 伟, 王志成

（1. 吉林大学公共卫生学院 国家卫健委放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021；2. 武警吉林总队医院第二门诊部，吉林 长春 130052）

目前有关电离辐射对人体的作用已积累了大量资料，关于低剂量电离辐射（low dose radiation，LDR）的生物学作用，特别是对神经系统的作用，已成为人们关注的焦点［1-4］。早期的研究［5］表明：LDR 对大脑具有保护作用，其原因可能是LDR 增加抗氧化特性和降低脂质过氧化。体内实验研究［6-8］表明：LDR 不能诱导有害的认知改变，对神经细胞功能、DNA 和相关基因表达无明显影响，并且可以刺激细胞和分子的保护效应。研究［9-10］表明：糖尿病（diabetes mellitus，DM） 高血糖状态时可促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，ROS 生成增加导致胰岛β 细胞生长阻滞和细胞凋亡的发生，是DM 发生机制之一。在对大脑神经损伤的防护中，抗氧化是一个重要的途径，LDR 通过诱导抗氧化活性对大脑发挥保护作用，且对大脑不具有损伤效应［11-12］。因此，本研究通过链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导Wistar 大鼠建立DM 模型，给予LDR 处理，探讨大鼠海马神经元细胞周期进程、钙离子浓度（［Ca2+］i）和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）的变化，为DM 脑损伤的治疗提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器60 只雄性Wistar大鼠购自吉林大学白求恩医学部实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（吉）203-2007。实验前大鼠室内适应环境1 周，自由进水和进食。STZ、Fluo-3 和Pluronic F-127（美国Sigma 公司），罗丹明123（大连美仑生物技术有限公司），其他试剂为国产分析纯。血糖仪及配套试纸（美国强生公司），X-RAD 320iX 生物辐照仪（美国Precision X-ray 公司）。

1.2 大鼠DM 模型制备大鼠造模前禁食12 h，不禁水，造模时行50 mg·kg－1STZ（10 g·L－1）左下腹腔一次性注射，注射2 d 后利用尿糖试纸检测空腹12 h 尿糖，取尿糖≥大鼠再次注射STZ，3 d 后尾静脉取血利用血糖试纸检测，如血糖值大于16.7 mmol·L－1，且出现“三多一少”症状，则可以认定大鼠DM 模型制备成功。

1.3 实验动物分组及LDR造模成功大鼠分为DM 组、DM + 25 mGy X 射线照射组、DM+50 mGy X 射线照射组和DM + 75 mGy X 射线照射组，同时选取正常大鼠作为正常对照组，每组12 只。LDR 采用X-RAD 320iX 生物辐照仪照射，剂量率为12.5 mGy·min－1，电压180 kV，电流15 mA，隔日照射，照射12 次。

1.4 流式细胞术检测大鼠不同细胞周期海马神经元百分率LDR 照射结束后继续饲养4 周，麻醉后处死大鼠，迅速取出大脑后置于冰上，剪开大脑后轻柔地剥离海马，并置于冷生理盐水中漂洗血液，每组取4 只，放于5 mL PBS 缓冲液中，利用毛玻璃轻轻研磨成单细胞悬液，并经200 目尼龙网过 滤，1 500 r·min－1离 心5 min 后 计 数，定 容后 待 测。 取 1×106个 细 胞，加 入 RNA 酶（0.03 g·L－1）80 μL，PI （0.05 g·L－1，含0.03%Triton X-100）150 μL，4 ℃条件下避光30 min 后采用流式细胞仪检测不同细胞周期细胞百分率，采用CellQuest 软件收集细胞，至少收集1 × 104个细胞，ModFit 软件分析结果，结果以百分率表示。

1.5 大鼠海马神经元中［Ca2+］i 检测每组取上述1 × 106个大鼠海马神经元，PBS 缓冲液洗2 次后加入Fluo-3（终浓度为5 μmol·L－1） 和Pluronic F-127（终浓度为0.062 5%），室温条件下孵育30 ～50 min，PBS 缓冲液再洗2 次后，采用CellQuest 软件收集细胞，至少收集1 × 104个细胞，ModFit 软件进行［Ca2+］i 检测，以平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI） 值表示大鼠海马神经元中［Ca2+］i。

1.6 大鼠海马神经元MMP 检测每组取上述海马神经元1 × 106个，PBS 缓冲液洗2 次后加入0.2 μL 罗丹明123，37 ℃条件下反应15 min，PBS缓 冲 液 洗2 次，1 500 r·min－1离 心5 min，上 机 检测，CellQuest 软件收集至少1 × 104个细胞，ModFit 软件进行结果分析，以MFI 值表示大鼠海马神经元MMP。

1.7 统计学分析采用SPSS 24.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠体质量、海马神经元中不同细胞周期细胞百分率、［Ca2+］i 和MMP 均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠体质量造模成功后未进行LDR前，各组大鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05），可以用于后续研究。正常对照组大鼠体质量随着时间的延长逐渐增加；与正常对照组比较，DM 组、DM+25 mGy X射线照射组、DM+50 mGy X 射线照射组和DM + 75 mGy X 射线照射组大鼠体质量在各时间点均明显降低（P＜0.05）；与DM 组比较，X 射线照射后4 周后DM + 50 mGy X 射线照射组和DM +75 mGy X 射线照射组大鼠体质量明显增加（P＜0.05）。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠体质量Tab.1 Body weights of rats in various groups at different time points

表1 不同时间点各组大鼠体质量Tab.1 Body weights of rats in various groups at different time points

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group Body weight 4 weeks after LDR 524.0±15.1 215.2±1.7*223.2±4.4*234.0±28.4*△238.8±5.8*△Normal control DM DM + 25 mGy X-ray irradiation DM + 50 mGy X-ray irradiation DM + 75 mGy X-ray irradiation Before LDR 211.0±10.7 207.2±18.3 204.0±11.4 204.6±10.4 199.2±7.3 2 weeks of LDR 260.8±10.5 209.2±2.7*206.9±1.6*212.5±1.9*209.5±2.7*4 weeks of LDR 324.0±19.1 212.2±7.7*216.2±4.4*224.0±5.4*223.8±5.8*

2.2 各组大鼠不同细胞周期海马神经元百分率与正常对照组比较，DM 组、DM+25 mGy X 射线照射组、DM+50 mGy X 射线照射组和DM +75 mGy X 射线照射组大鼠S 期海马神经元百分 率 明 显 增 加（P＜0.05）； 与DM 组比较，DM + 25 mGy X 射 线 照 射 组、DM + 50 mGy X 射线照射组和DM+75 mGy X 射线照射组大鼠S 期海马神经元百分率明显降低（P＜0.05）。见 图1 和表2。

图1 流式细胞术检测各组大鼠不同细胞周期海马神经元百分率Fig.1 Percentages of hippocampal neurons in different cell cycles of rats in various groups detected by flow cytometry

表2 各组大鼠不同细胞周期海马神经元百分率Tab. 2 Percentages of hippocampal neurons at different cell cycles of rats in various groups

表2 各组大鼠不同细胞周期海马神经元百分率Tab. 2 Percentages of hippocampal neurons at different cell cycles of rats in various groups

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs DM group.

Group S Normal control DM DM + 25 mGy X-ray irradiation DM + 50 mGy X-ray irradiation DM + 75 mGy X-ray irradiation Percentage of hippocampal neurons G0/G1 87.6±3.8 85.4±0.9 3.9±0.4 6.3±0.3*G2/M 8.6±0.6 8.4±1.0 87.7±2.6 4.7±0.8*△7.6±1.4 87.2±0.8 3.5±0.4*△9.7±0.9 86.4±2.5 4.5±0.6*△9.1±0.9

2.3 各组大鼠海马神经元中［Ca2+］i 和MMP与正常对照组比较，DM 组、DM+25 mGy X 射线照射组和DM + 50 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元中［Ca2+］i明显增加（P＜0.05），DM + 75 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元中［Ca2+］i 明显降低（P＜0.05）；与DM 组比较，DM + 50 mGy X 射线照射组和DM + 75 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元中［Ca2+］i 明显降低（P＜0.05）；与DM+25 mGy X 射线照射组比较，DM+75 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元中［Ca2+］i 明显降低（P＜0.05）。与正常对照组比较，DM 组和DM + 25 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元MMP 明显降 低（P＜0.05）；与DM 组 比 较，DM+50 mGy X 射线照射组和DM + 75 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元MMP 明显升高（P＜0.05）；与DM+25 mGy X 射线照射组比较，DM+50 mGy X 射 线 照 射 组 和DM + 75 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元MMP 明显升高（P＜0.05）。见图2 和表3。

图2 流式细胞术检测各组大鼠海马神经元MMPFig.2 MMP of hippocampal neurons of rats in various groups detected by flow cytometry

表3 各组大鼠海马神经元中[Ca2+]i 和MMPTab. 3 [Ca2+] i and MMP of hippocampus neurons of rats in various groups

表3 各组大鼠海马神经元中[Ca2+]i 和MMPTab. 3 [Ca2+] i and MMP of hippocampus neurons of rats in various groups

*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs DM group；#P＜0.05 vs DM + 25 mGy X-ray irradiation group.

Group Normal control DM DM+ 25 mGy X-ray irradiation DM+ 50 mGy X-ray irradiation DM+ 75 mGy X-ray irradiation[Ca2+]i 9.4±0.9 14.7±1.5*14.8±0.5*12.2±0.6*△6.5±0.4*△#MMP 31.3±4.3 25.1±1.4*25.8±1.0*30.5±1.6△#29.1±0.1△#

3 讨 论

STZ 诱导DM 时，高血糖影响大脑各个区域神经元的降解，包括扣带回皮质、丘脑核和海马体，主要与ROS 的产生有关［13-14］。

海马体对记忆具有重要作用，能够将其存入大脑皮层转变成永久记忆。海马神经元一旦受损，则出现明显的记忆力下降现象，并导致焦虑症的发生［15］。因此，如何提高DM 神经损伤的保护作用具有重要的意义。以往研究［6-8］显示：LDR 对细胞具有抗氧化和抑制凋亡的作用。

研究［16-18］表明：DM 时海马神经元由高 血 糖诱导的凋亡是海马损伤的一个重要途径。而且在凋亡过程中，凋亡的线粒体调控途径涉及到持续的高血糖状态，可以使MMP 及细胞膜渗透性发生变化，膜通透性转运孔开放，膜去极化，使得线粒体内促凋亡因子释放到细胞浆中，激活caspase-3，引发级联反应，从而诱发细胞凋亡。在此过程中，MMP 的改变是早期事件。在本研究中，DM 模型大鼠海马神经元MMP 较正常对照组明显降低，而25 mGy LDR 未能逆转MMP 的降低，但50 和75 mGy 的LDR 则使MMP 基本恢复到正常水平，提示其具有抗凋亡的作用。另外，［Ca2+］i 的改变也是细胞凋亡的一个指标，当细胞膜去极化后，可以诱导细胞内钙离子堆积，浓度升高，进而启动细胞凋亡［19-20］。

研究［21-22］表明：氧化应激与钙离子平衡之间也存在交互作用，如顺铂诱导ROS 生成时，也能够破坏钙离子平衡。本研究结果显示：DM 模型组大鼠海马神经元中［Ca2+］i 明显升高，而DM +50 mGyX 射线照射组和DM + 75 mGy X 射线照射组大鼠海马神经元中［Ca2+］i 明显降低。细胞周期进程按照一定的顺序有序进行，在外来刺激下，细胞周期检查点激活，从而使细胞发生阻滞，以完成对外来刺激的适应。当细胞发生周期阻滞时，影响细胞DNA 合成和分裂等事件，甚至可以诱导凋亡。本研究结果显示：DM 组大鼠海马神经元中S 期细胞百分率明显升高，提示DM 发生后海马神经元产生明显的S 相延迟，而LDR 则能有效地降低该作用，从而使细胞恢复到正常的有丝分裂状态。

综上所述，本研究利用STZ 诱导建立大鼠DM模型，LDR 能有效地减轻DM 大鼠海马神经元损伤，其机制主要是通过改善DM 大鼠海马神经元S 期延迟、恢复海马神经元中［Ca2+］i 和逆转MMP 降低，进而发挥神经保护作用。本研究结果为LDR 治疗DM 脑损伤提供了必要的实验证据。