aaptamine 与顺铂联合用药对人肺腺癌顺铂耐药A549/DDP 细胞的协同抑制作用

苗 双, 倪 娜, 杨丽娟, 武 艳, 李雪琳, 董洪亮, 宫凯凯

（1. 滨州医学院附属医院肿瘤研究实验室，山东 滨州 256603；2. 滨州医学院附属医院临床实验中心，山东 滨州 256603）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，约占肿瘤致死率的27%，随着大气污染和吸烟人群的增加，肺癌成为威胁人类健康的头号杀手［1-3］。以铂类为基础的化疗，尤其是顺铂（DDP），是治疗肺癌最为有效的化疗药物［4］，然而肺癌细胞耐药性的产生严重限制了DDP 的临床应用［5］，因此逆转DDP 耐药性或增强其化疗敏感性是目前临床上亟待解决的问题［6-7］。aaptamine 分离自寻常海绵纲海绵，是一种具有特殊苯并二氮杂萘母核的典型海洋来源生物碱［8］。研究［9-11］表明：aaptamine 具有良好的抗肿瘤活性，在慢性髓细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）细胞和骨肉瘤细胞中，aaptamine能够不依赖于P53 诱导P21 的表达，在较低浓度时将细胞周期阻滞于G2/M 期，而在较高浓度时则不同程度地诱导细胞凋亡。在DDP 耐药的人胚胎细胞癌NT2-R 细胞中，aaptamine 能够抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡，通过对蛋白表达谱分析推测c-myc 和P53 可 能 为aaptamine 的 作 用 靶 点［12］。BOWLING 等［13］发 现：aaptamine 可 以 与DNA 发生交联作用因而具有细胞毒抗病毒活性。此外，FUNK 等［14］发 现：aaptamine 能 够 通 过 干 扰DDP引起的DNA 损伤反应（DNA damage response，DDR），减轻DDP 对大鼠肾细胞的作用。鉴于aaptamine 良好的抗肿瘤活性和对化疗损伤的保护作用，有必要对其作用机制进行深入的研究。目前国内外关于aaptamine 联合DDP 协同抑制肺癌的研究尚未见报道。本实验室前期通过天然产物分离技术，获得aaptamine 单体，且证实aaptamine 可以明显抑制肺癌A549 细胞和H1299 细胞的增殖。本研究通过多种实验方法探讨aaptamine 和DDP 联合用药对人肺腺癌DDP 耐药细胞A549/DDP 的协同抑制作用及其抗耐药分子机制，以期为克服肿瘤化疗耐药瓶颈提供新线索。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人肺腺癌DDP 耐药细 胞 A549/DDP 购 自 美 国 ATCC 细 胞 库。aaptamine 为本实验室从海绵Aaptos suberitoides中分离得到，化学结构见图1。胎牛血清、RPMI-1640 培养基和胰酶购自美国Gibco 公司，DDP 购自美国MCE 公司，B 细胞淋巴瘤2 原癌基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相 关X 蛋 白（Bcl-2-associated X，Bax）、 三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2 （ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2） 和切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementing group 1，ERCC1） 单克隆抗体购于美国Abcam 公司，Tublin 抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体购于美国Proteintech 公司，CCK-8 试剂盒购于日本同仁化学研究所，膜联蛋白V-FITC/PI 检测试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。CO2细胞培养箱购于美国Thermo 公司，倒置显微镜购于德国Leica 公司，酶标仪购于美国BioTek 公司。

图1 aaptamine 的化学结构Fig.1 Chemical structure of aaptamine

1.2 细胞培养A549/DDP 细胞用含有10%胎牛血清和1% 青霉素-链霉素的RPMI-1640 培养基，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养和传代。

1.3 半数抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）的测定和药物组合方案的筛选取对数生长期A549/DDP 细胞制备单细胞悬液，采用台盼蓝计数，将细胞以1×104个/孔接种于96 孔细胞培养板，每孔接种100 μL 细胞悬液，培养24 h 后采用药 物 处 理，DDP 浓 度 梯 度 为0、 1.25、 2.50、5.00、10.00 和20.00 mg·L－1，aaptamine 浓度梯度为0、1、2、4、8、16、32 和64 mg·L－1，每 孔行3 个重复，培养48 h 后，每孔加入10 μ L CCK-8溶液，继续培养2 h，应用酶标仪测定各孔在450 nm 波长处的吸光度（A）值，以仅加入培养基的对照孔为空白调零，实验重复3 次。用Graphpad Prism 7.0 软件计算IC50值，以药物浓度的对数值为横坐标，细胞存活率为纵坐标，细胞存活率为50%时对应的药物浓度为IC50值。以aaptamine 的IC50值 为 参 考，设 置 浓 度 为5、 10、 15 和20 mg·L－1，为减少DDP 的不良反应，将DDP 浓度设置为1 和2 mg·L－1，分别单独加药或两两组合，采用CCK-8 法考察单独及联合用药后细胞的抑制率，利用CompuSyn 软件中的Chou-Talalay 中效分析法［15］对CCK-8 法检测结果进行分析，计算联合指数（CI）值，若CI＜1，认为两药为协同作用，CI＝1 为相加作用，CI＞1 为拮抗作用。

1.4 CCK-8 法检测各组细胞增殖活性取对数生长期A549/DDP 细胞制备单细胞悬液，采用台盼蓝计数，将细胞以1×104个/孔接种于96 孔板，每孔接种100 μL细胞悬液。细胞培养24 h后分为4组：对照组不加药，aaptamine 组加入5 mg·L－1aaptamine，DDP 组 加 入1 mg·L－1DDP，联 合 用 药 组 加入5 mg·L－1aaptamine 和1 mg·L－1DDP，每 孔行3 个重复，分别在24、36、48、60 和72 h 加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养2 h，应用酶标仪测定各孔在450 nm 波长处的A 值，以仅加入培养基的对照孔为空白调零，实验重复3 次，以平均A 值代表细胞增殖活性，对照组进行均一化处理后，采用GraphPad Prism 7.0 软件绘制细胞生存曲线。

1.5 克隆形成实验检测各组细胞克隆数细胞分组方法同“1.4”。按每孔500 个A549/DDP 细胞的密度接种于12 孔板，每孔接种1 mL 细胞悬液。37 ℃孵育24 h 后加药处理，后每隔3 d 更换1 次含有药物的培养液，处理14 d 后，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 缓冲液洗脱3 次，结晶紫染色20 min，PBS 缓 冲 液 洗 脱3 次，拍 照，采 用Image J 软件统计数据，计算细胞克隆数，以细胞克隆数＞50 计为1 个克隆。实验重复3 次。

1.6 细胞划痕实验检测各组细胞迁移率细胞分组方法同“1.4”。将A549/DDP细胞按1×105个/孔的密度接种于6 孔板，每孔接种1 mL 细胞悬液，细胞培养至80%左右时用200 μL 无菌枪头划痕并加药处理，加药0、24 和48 h 后于倒置显微镜下观察、拍照，采用Image J 软件对划痕距离进行分析，并用Graphpad Prism 7.0 软件计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h 划痕间距－24 或48 h 划痕间距）/0 h 划痕间距×100%。实验重复3 次。

1.7 流式细胞术检测各组细胞凋亡率细胞分组方法同“1.4”。 将A549/DDP 细胞按1×105个/孔的密度接种于6 孔板，每孔接种1 mL 细胞悬液，培养24 h 后加药处理。药物处理48 h 后收集细胞，采用膜联蛋白V-FITC/PI 检测试剂盒测定细胞凋亡率，用预冷的PBS 缓冲液洗涤2 次并轻轻重悬于100 μL 结合缓冲液中，采用5 μL 膜联蛋白V-FITC和5 μL PI 溶液染色，并采用流式细胞仪检测。采用FlowJo 7.6 软件进行进行数据分析，细胞凋亡率＝（早期凋亡细胞数＋晚期凋亡细胞数）/细胞总数×100%。实验重复3 次。

1.8 Western blotting 法检测各组细胞中ABCG2、ERCC1、Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平细胞分组方法同“1.4”。 将A549/DDP 细胞按1×105个/孔的密度接种于6 孔板，每孔接种1 mL 细胞悬液，培养24 h 后用药处理。药物处理72 h 后收集细胞提取细胞总蛋白，BCA 法定量蛋白浓度，取30 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 后，PVDF 转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗（1∶1 000） 孵育过夜，TBST 清洗，二抗（1∶2 000） 孵育2 h，TBST 清洗，ECL 显色曝光。实验重复3 次，采用Image J 分析软件，以Tubulin 蛋白为内参，计算目的蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 蛋白表达水平比值。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.9 统计学分析采用Graphpad Prism 7.0 软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性、克隆数、细胞划痕愈合率、细胞凋亡率及各蛋白表达水平和Bax/bcl-2 比值，均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1aaptamine 和DDP 的IC50 值 及 联 合 用 药 药 物浓度的确定首先测定aaptamine 和DDP 单独用药对A549/DDP 细 胞 的IC50值，aaptamine 和DDP 的IC50值分别为19.45 和12.86 mg·L－1。采用CCK-8法检测不同浓度aaptamine 与不同浓度DDP 单独或联合用药后A549/DDP 细胞抑制率，并用CompuSyn 软件计算两者的CI，结果显示：5、10、15 和20 mg·L－1aaptamine 与1 或2 mg·L－1DDP的CI 均小于1，说明二者均有协同作用，当aaptamine 浓度为5 mg·L－1、DDP浓度为1 mg·L－1时，A549/DDP 细胞的抑制率为41%。因此为减少药物的不良反应，选择最小的药物浓度，即aaptamine 5 mg·L－1和DDP 1 mg·L－1作 为 后 续 实验浓度。

2.2 各组A549/DDP 细胞增殖活性加药处理后48、60 和72 h，与 对 照 组、aaptamine 组 和DDP 组比较，联合用药组细胞增殖活性明显降低（P＜0.01）。见图2。

图2 CCK-8 法检测各组细胞增殖活性Fig. 2 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK-8 assay

2.3 各组A549/DDP 细胞克隆数加药处理后各组细胞培养14 d，联合用药组细胞克隆数（42.0±8.0）明显低于对照组（180.5±25.0）、aaptamine组（144.5±15.0） 和 DDP 组 （115.5±12.0）（P＜0.05 或P＜0.01）。见图3。

图3 结晶紫染色观察各组细胞克隆形成能力Fig.3 Colonal formation abilities of cells in various groups detected with crystal violet

2.4 各组A549/DDP 细胞迁移率加药处理24 h后，对照组、aaptamine 组、DDP 组和联合用药组细胞迁移率分别为（55.00±5.31）%、（45.80±4.83）% 、 （29.40±3.57）% 和 （17.30±2.31）%；加药处理48 h后，对照组、aaptamine组、DDP 组和联合用药组细胞迁移率分别为（70.40±8.31）%、（67.70±5.25）%、（54.50±4.89）%和（27.8±2.19） %。加药处理24 和48 后，与对照组、aaptamine 组和DDP 组比较，联合用药组细胞迁移率明显降低（P＜0.01）。见图4。

图4 细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力（×40）Fig.4 Migration abilities of cells in various groups detected by scratch assay（×40）

2.5 各组A549/DDP 细胞凋亡率对照组、aaptamine 组、DDP 组和联合用药组细胞凋亡率分别 为 （13.97±4.05）% 、（29.65±2.09）% 、（45.03±5.05）%和（56.40±2.95）%，与 对 照组、aaptamine 组和DDP 组比较，联合用药组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见图5。

2.6 各 组A549/DDP 细 胞 中ABCG2 和ERCC1 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比值与对照组、aaptamine 组和DDP 组比较，联合用药组细胞中ABCG2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），Bax/Bcl-2 比值明显升高（P＜0.01）；与对照组比较，联合组A549/DDP 细胞中ERCC1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图6 和表1。

图5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.5 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

图6 Western blotting 法检测各组细胞中ABCG2、ERCC1、Bcl-2 和Bax 蛋白表达电泳图Fig.6 Electrophoregram of expressions of ABCG2，ERCC1, Bcl-2, and Bax proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

肺癌化疗耐药性的产生是一个多因素参与的复杂 过 程［16-18］。研 究［19-23］表 明：ABCG2 和ERCC1在肺癌耐药细胞中高表达，并与铂类耐药有密切关联。ABCG2 是ABC 转运体家族内一种耐药蛋白，可以将大部分化疗药物泵出细胞外，从而导致多药耐药现象的产生［24］。ERCC1 在核苷酸切除修复途径中起到重要作用，是修复顺铂引起的DNA 损伤所必须的，其过表达与顺铂耐药有密切关联［24-25］。因此下调ABCG2 和（或）ERCC1 的表达，有利于逆转DDP 耐药，增强肿瘤细胞对DDP 的敏感性。

表1 各组A549/DDP 细胞中ABCG2 和ERCC1 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比值Tab. 1 Expression levels of ABCG2 and ERCC1 proteins and ratios of Bax/Bcl-2 in A549/DDP cells in various groups

近年来，海洋天然产物在抗肿瘤新药研发中越来越受到关注［26］，目前已有6 种被FDA 批准的该类 抗 肿 瘤 药 物［27］。aaptamine 是aaptos 属 海 绵 中 的特征性成分，前期研究［9-12，14］表明：aaptamine 对多种肿瘤细胞具有良好的抑制活性，但未见其与DDP 联合用药的相关研究报道。本研究结果显示：aaptamine 与DDP 联合用药可明显抑制A549/DDP细胞的增殖、克隆形成和迁移能力，并且通过增加凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 表达水平的比例促进肿瘤细胞的凋亡；另外，联合用药组细胞中ABCG2蛋白表达水平较对照组和单独用药组均明显下调，ERCC1 蛋白表达水平较对照组下调，表明联合用药抑制ABCG2 和ERCC1 的蛋白表达。 推测aaptamine 与DDP 联合应用对A549/DDP 细胞具有协同抑制作用，其分子机制可能与抑制耐药基因的表达有关，但其具体机制尚有待于进一步研究。

综上所述，低浓度aaptamine 联合低浓度DDP能明显增强肺癌A549/DDP 细胞对DDP 的敏感性，两药联合使用不仅提高了药物治疗效果，还可以减少单一药物的使用剂量，进而减轻药物的不良反应。本研究为逆转DDP 耐药提供了新思路。