探讨TLR4/NF-κB信号通路在急性心肌梗死大鼠梗死区的作用

陈微 徐宇啸

近年来，我国急性心肌梗死（AMI）发病率的趋势逐渐上升，且呈年轻化［1］。Toll样受体（TLRs）是一种跨膜蛋白家族成员，称为模式识别受体，是哺乳动物中唯一将细胞外抗原信息导入细胞并引发炎症反应的分子［2］。其中，Toll样受体4（TLR4）在免疫防御和免疫调节中通过识别和结合多种内源性和外源性配体扮演者重要角色［3］。核因子κB（NF-κB）是一种广泛应用的转录因子，能特异性结合许多基因的启动子和增强子，参与炎症、免疫应答、细胞增殖和凋亡等多种过程［4］。已有大量研究表明NF-κB信号的激活与动脉粥样硬化有关，而动脉粥样硬化又是心血管疾病的重要原因［5］。然而，AMI导致心肌细胞损伤的分子机制尚不完全明确。心肌缺血再灌注后的血流量恢复至缺血前的组织中，对心肌造成不可逆转的损伤，降低细胞活性［6］。因此，迫切需要全面了解AMI发病过程中的机制，本研究通过观察AMI大鼠中心肌组织TLR4、NF-κB的变化来探讨其在AMI大鼠梗死区的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 红四氮唑（TTc）购自美国Sigma公司；门冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒及HE染色试剂盒均购自北京索莱宝公司；兔TLR4多克隆抗体、兔NF-κB单克隆抗体及HRP标记的山羊抗兔抗体均购自碧云天生物公司。8周龄清洁级雄性SD大鼠，体重260～280g，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 实验方法 （1）模型的制备与分组：35只SD大鼠于清洁级别动物房内适应性饲养1周，室温22℃～26℃，标准12h光/暗循环昼夜交替，固定饲料喂养，自由饮食。术前禁食＞6h，随机将25只大鼠4%水合氯醛麻醉后，分离并结扎左冠状动脉前降支起始部，建立AMI大鼠模型［7］，手术过程中实施心电图监测，以左心室前壁呈灰白至发绀、心电图ST段抬高或T波高耸为造模成功标志。另将剩余的10只大鼠仅分离冠状动脉不结扎，设为假手术组。术后选取AMI建模成功且精神状态恢复良好的大鼠20只，随机分为模型组10只，给药组10只。其中，给药组在术前后进行给药（阿司匹林30mg/kg）干预1周，假手术组和模型组灌服等剂量的生理盐水。给药1周后处死大鼠，收集血清、心脏组织。（2）各组大鼠心肌酶含量检测：各组大鼠麻醉后，开腹腔进行腹主动脉取血，离心（3500 r/min，5min），取上清液采用全自动生化分析仪检测心肌酶（AST、CK与CK-MB）含量。（3）各组大鼠心脏/体质量比、心肌梗死面积的测定：取血结束后开胸腔，取心脏组织称重，计算心脏/体质量比；将心脏从底部至顶部水平切成5～6片于2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）37℃染色15min，染色后正常组织呈红色，梗死部位呈苍白色，采用Image J软件测量心肌梗死面积，即梗死面积/（梗死面积加上非梗死面积）×100%。（4）HE染色观察各组大鼠心肌组织病理变化：取部分心脏组织于4%多聚甲醛固定过夜，脱水石蜡包埋后制成2～3μm切片，水化后进行HE染色观察心肌组织的病理改变。（5）免疫组织化学检测各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4蛋白表达：取心脏石蜡块制成4～5μm切片，水化后进行抗原修复，一抗NF-κB、TLR4（1∶50）4℃孵育过夜，次日二抗室温孵育2h后，DAB显色，苏木素复染，快速脱水透明封片。光学显微镜采集图像，每张切片随机取10个视野，采用IPP图像分析系统分析心肌组织切片的蛋白平均光密度，以此来评估NF-κB、TLR4蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。单因素方差分析组间差异，计量资料以表示；采用Pearson分析模型组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平与心肌梗死面积的相关性，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏/体质量比、心肌梗死面积和心肌酶含量比较 见表1。

表1 各组大鼠心脏/体质量比、心肌梗死面积和心肌酶含量（）

表1 各组大鼠心脏/体质量比、心肌梗死面积和心肌酶含量（）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 n 心脏/体质量比（10-3）心肌梗死面积（%）心肌酶AST（%） CK（%） CK-MB（%）假手术组 10 2.46±0.42 4.37±0.13 120.23±28.47 401.59±101.58 662.72±141.43模型组 10 4.53±1.12* 48.53±8.61* 159.98±67.35*421.46±129.42* 973.58±220.86*给药组 10 3.76±0.58# 26.24±5.37# 130.11±45.22# 429.52±0.42 782.33±139.12#

2.2 各组大鼠心肌组织病理形态变化 HE病理染色结果显示，假手术组心肌细胞排列整齐无异常，未见炎性细胞浸润；与假手术组比较，模型组大鼠心肌纤维紊乱，心肌细胞数量明显减少，出现致密炎性浸润和间质水肿，且胞核固缩、深染；而与模型组比较，给药组大鼠心肌组织中炎性细胞、水肿和心肌细胞损伤均有所减轻。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态变化（HE，×200）

2.3 各组大鼠心肌组织NF-κB、TLR4蛋白表达 与假手术组比较，模型组TLR4、NF-κB蛋白表达水平明显增加（P＜0.05），呈棕黄色颗粒广泛分布；与模型组比较，给药组的TLR4、NF-κB蛋白表达水平稍有所降低（P＜0.05）。见图 2。

2.4 心肌组织TLR4/NF-κB蛋白表达水平与心肌梗死面积的相关性分析 相关性分析结果显示，模型组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平与心肌梗死面积呈正相关（r=0.758、0.672，均P＜0.05）。见图 3。

3 讨论

心肌缺血损伤导致心功能紊乱、心肌细胞凋亡在AMI发生过程中持续存在。心肌细胞受损后，细胞膜结构破坏导致通透性增加，细胞内酶释放至血液中，血清心肌酶如AST、CK等含量增加［8］。因此，通过检测血清心肌酶水平，可间接反映心肌损伤程度。本研究通过结扎大鼠冠状动脉建立AMI模型，发现与假手术组比较，模型组大鼠心脏/体质量比、心肌梗死面积和心肌酶含量均明显高于假手术组（P＜0.05），HE病理染色显示心肌纤维紊乱，心肌细胞数量明显减少，出现致密炎性浸润和间质水肿，且胞核固缩、深染，提示大鼠AMI模型建立成功，并表现出心肌细胞损伤。

图2 免疫组化检测各组大鼠心肌组织TLR4、NF-κB表达图（IHC，×200），⋆P＜0.05

在AMI发生过程中，局部心肌细胞死亡导致弥漫性炎性细胞浸润［9］。据报道，TLRs在诱导心肌梗死和病毒性心肌炎等心脏病的炎症反应中起着重要作用［10］。既往有研究表明，在肝脏缺血/再灌注损伤中，TLR4途径可通过直接或间接激活NF-κB信号，调节促炎细胞因子的产生，进而促炎因子又能刺激NF-κB的活化，加重炎症损伤［11］。TLR4是心肌细胞主要表达的Toll样受体，在模型组的心肌组织中TLR4、NF-κB蛋白表达水平明显增加（P＜0.05），且呈棕黄色颗粒广泛分布。阿司匹林作为一种非甾体抗炎药，是治疗缺血性心脏病的临床长期用药之一，能防止血小板的聚集，避免血栓形成［12］。在本研究中，对AMI大鼠术前、术后给予阿司匹林进行干预1周发现，与模型组比较，给药组大鼠心脏/体质量比和心肌组织梗死面积均明显低于模型组（P＜0.05），心肌酶除了CK变化不明显外，AST与CK-MB均较模型组有所降低（P＜0.05），病理染色显示心肌组织中炎性细胞、水肿和心肌细胞损伤均有所减轻，心肌组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平也稍有所降低（P＜0.05）。提示阿司匹林可能通过抑制TLR4/NF-κB信号途径来发挥其保护作用，减轻AMI导致的心肌损伤［13］。最后，为了进一步分析TLR4/NF-κB信号途径在AMI大鼠梗死区的作用，采用Pearson分析AMI大鼠心肌组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平与心肌梗死面积的相关性，结果显示TLR4、NF-κB与心肌梗死面积呈正相关（P＜0.05），提示TLR4/NF-κB可能参与了心肌梗死的过程，可能是AMI发生的重要预测性生物标记物，但具体的作用机制仍需进一步的分子生物学研究。

综上所述，TLR4/NF-κB信号通路在AMI大鼠模型中表达升高，可能在心肌梗死过程中发挥着重要作用，为TLR4/NF-κB作为AMI治疗靶点提供了新的依据。