miR-451在脓毒症大鼠血清中的表达及意义

张军 朱海勇

脓毒症（sepsis）是由感染引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），其发病机制复杂：包括病原微生物对组织器官的直接损伤和机体免疫功能紊乱等［1］，脓毒症导致各种炎性因子和炎性介质如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素（IL）-6、C反应蛋白（CRP）等大量释放和活化，从而引起促炎因子和抗炎因子的平衡失调，机体免疫功能受到损伤。为了进一步深入研究脓毒症的发病机制和诊断、预后的新方法，越来越多的科学家开始将基因调控技术应用于脓毒症的研究，寻找脓毒症分子生物学靶标逐渐成为研究热点。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为20～25个核苷酸的非编码小RNA分子，在同源及不同源物种中具有高度一致性［2］。越来越多的研究显示miRNA的表达与脓毒症密切相关，不同miRNA在脓毒症中表达也不同［3］。其中miRNA-451已被证实与炎症的发生发展密切相关［4］。本研究通过盲肠结扎穿刺方法建立脓毒症大鼠模型，探究脓毒症大鼠血清中miR-451的表达情况及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit（日本 Takara公司）；miR-451模拟物、抑制剂和对照剂（广州锐博生物科技有限公司）；TNF-α、IL-6和CRP酶联免疫分析试剂盒（上海信然生物技术有限公司）。

1.2 实验方法 （1）盲肠结扎穿刺脓毒症大鼠模型建立及分组：清洁级SD大鼠45只，200～250g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号为SCXK（沪）2013-0018。将大鼠随机分成3组，分别为正常对照组、假手术组、脓毒症组。其中正常对照组5只：正常饲养，不做任何处理；假手术组20只：大鼠麻醉后开腹，不做模型诱导处理；脓毒症组20只：大鼠麻醉后开腹，行盲肠结扎穿刺术建立脓毒症大鼠模型。其中假手术组和脓毒症组按术后3h、6h、12h、24h分为四个小组，每组各5只。采用文献提供的方法制备脓毒症大鼠模型［5］，假手术组在剖腹后暴露并翻动盲肠，但不进行结扎和穿刺。给予术后大鼠皮下注射生理盐水以进行液体复苏。（2）大鼠血清中炎症因子和miR-451表达量检测：将各组大鼠麻醉后仰卧于固定台，开腹后用注射器取下腔静脉血8～10ml，分别置于2ml微量离心管，并将其于室温下放置1h后离心收集上清液，置于-80℃冰箱保存待测。TNF-α、IL-6和CRP三个指标用商品化酶联免疫分析试剂盒检测，实验严格按照试剂盒说明书进行操作。采用qRTPCR检测miR-451在大鼠血清中的表达量情况。取出备用血清，按1：1加入1ml Trizol试剂提取总RNA，按照反转录试剂盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Ki试剂盒进行逆转录和qRT-PCR。以U6作为内参基因。扩增后获取各组Ct值，采用2-△△ct法计算相对表达量。miR-451上游引物序列：5"-CCGAAACCGTTACCATTAC-3"，下游引物序列：5"-GTGCAGGGTCCGAGGT-3"。U6上游引物序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。（3）脓毒症大鼠的miR-451外源性干预：清洁级SD大鼠20只，随机分成模型组、miR-451mimic组、miR-451 inhibitor组、miR-451 NC，每组各5只。术后采用尾静脉注射法立即向模型组、miR-451mimic组、miR-451 inhibitor组、miR-451 NC组大鼠分别注射生理盐水、miR-451模拟物、miR-451抑制剂、miR-451对照剂各10μl（0.02nmol/μl）。继续正常饲养24h后进行相关指标测定。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血清中炎症因子的表达变化 如表1所示，正常对照组大鼠血清中TNF-α的表达量为（29.9±3.8）pg/ml，IL-6的表达量为（48.6±12.6）pg/ml，CRP的表达量为（1.5±0.2）pg/ml。假手术组和脓毒症组中三种炎症因子表达量均高于正常水平，并且在24h内，随着时间的增加表达量逐渐升高。同时，与假手术组同时间点相比较，脓毒症组大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP的表达量显著增高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠中炎症因子表达水平变化（）

表1 各组大鼠中炎症因子表达水平变化（）

注：与假手术同时间比较，*P＜0.05

组别 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml） CRP（pg/ml）假手术组 3h 46.8±11.3 52.3±9.6 1.9±0.3 6h 92.3±21.4 88.6±12.4 2.4±0.4 12h 185.6±36.4 256.1±16.9 3.4±0.6 24h 225.3±41.2 269.6±23.4 3.7±0.4脓毒症组 3h 76.2±13.6* 88.6±12.4* 3.5±0.4*6h 173.9±26.3* 298.7±32.6* 8.5±0.6*12h 426.6±42.4* 523.6±48.6* 10.4±0.8*24h 448.4±52.4* 575.3±55.4* 10.3±1.2*正常对照组 29.9±3.8 48.6±12.6 1.5±0.2

2.2 大鼠血清中miR-451的表达变化 采用qRTPCR检测造模前后大鼠血清中miR-451的表达量情况，结果如图1所示，miR-451在正常对照组大鼠中维持在一个相对较高的水平。miR-451在假手术组大鼠中表达较正常对照组大鼠略微降低，随术后时间变化不明显。脓毒症大鼠血清中，miR-451在术后3h表达明显下调，并在24h内随时间的推移持续下降，变化幅度逐渐减缓。与假手术组同时间点相比较，脓毒症大鼠血清中miR-451表达显著降低（P＜0.05）。

图1 大鼠血清中miR-451的表达情况（与假手术组比较，⋆P＜0.05）

2.3 大鼠经过miR-451外源性干预之后血清中miR-451的表达变化 对脓毒症大鼠进行miR-451外源性干预后，采用qRT-PCR检测血清中miR-451表达情况，结果如图2，miR-451 NC组大鼠中miR-451表达与模型组无显著差异。而相对于miR-451 NC组大鼠，miR-451 inhibitor组大鼠中miR-451表达显著降低（P＜0.05），miR-451mimic组大鼠中miR-451的表达显著升高（P＜0.01），表明脓毒症大鼠的miR-451外源性干预成功。

图2 各组大鼠血清中miR-451的表达情况（与miR-451 NC组比较，⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01）

2.4 大鼠经过miR-451外源性干预之后血清中TNF-α、IL-6和CRP的表达变化 大鼠经过miR-451外源性干预之后检测血清中TNF-α、IL-6和CRP的表达变化，结果如表2所示，相对于miR-451 NC组，miR-451 inhibitor组大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表达量显著升高（P＜0.05），而miR-451 mimic组大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表达量显著降低（P＜0.05），结果表明miR-451能够有效降低脓毒症引起的炎症反应。

表2 各组脓毒症大鼠中炎症因子表达水平变化（）

表2 各组脓毒症大鼠中炎症因子表达水平变化（）

注：与miR-451 NC组比较，*P＜0.05

分组 TNF-α（pg/ml） IL-6（pg/ml） CRP（μg/ml）模型组 423.2±32.3 437.8±33.6 9.3±1.4 miR-451 NC组 411.6±36.6 402.8±36.9 8.9±0.9 miR-451 inhibitor组 601.3±52.3* 598.6±52.6* 16.5±1.5*miR-451 mimic 组 298.6±22.3* 233.4±25.6* 4.2±0.8*

3 讨论

近年来，越来越多的研究表明，C反应蛋白、趋化因子、细胞因子等与其他炎症相重合的分子标记均无特异性［6］，因此，寻找理想的脓毒症分子标记物是目前的重点。miRNA能够调控人类＞30%的基因表达［7］，多项研究表明，miRNA参与炎症、免疫及肿瘤的发生和发展［8］。近年来研究发现，miRNA表达与脓毒症密切相关，参与脓毒症的免疫调控，miRNA可通过影响炎症因子和炎症因子信号通路来调控失衡的炎症反应。有研究报道［9］，脓毒症患者中miR-18、miR-486表达上调，miR-146b、miR-150、miR-342表达下调，在临床诊断中血液样本采集较方便，应用广泛，目前病理状态下miRNA作为疾病生物标志物的研究已成热点。孟建斌等［10］通过大鼠miRNA-146a外源性干预，发现miRNA-146a能够通过靶向COX-2有效降低脓毒症引起的炎性反应。miR-451位于人类基因组17q11.2中，是一个多功能的miRNA，有文献报道［11］，miR-451能够通过靶向Psmb8抑制糖尿病肾病小鼠肾小球系膜细胞炎症反应，目前miR-451在脓毒症中的表达及作用机制报道较少。本研究通过建立脓毒症大鼠模型，研究miR-451在脓毒症大鼠中的表达，并进一步探究其作用机制。

目前已经证实TNF-α、IL-6和CRP的水平与脓毒症病情程度密切相关，其生成情况能反映炎症损伤的严重程度［12］。本研究中脓毒症组大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表达量较假手术组大鼠显著升高，表明模型组大鼠已经产生明显的炎症反应。同时，作者在脓毒症组大鼠血清中检测到miR-451表达量较假手术组显著降低，且在24 h内呈现持续下降的趋势。提示血清miR-451可能与TNF-α、IL-6和CRP一样，具有评估早期脓毒症的能力。脓毒症大鼠的miR-451外源性干预实验结果显示，相对于阴性对照组，注射miR-451抑制剂的脓毒症大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表达量显著升高，而注射miR-451模拟物的脓毒症大鼠血清中TNF-α、IL-6和CRP表达量显著降低，均具有统计学意义（P＜0.05）。此结果证实miR-451能够有效降低脓毒症引起的炎症反应。本研究的结论为后续更好的揭示脓毒症与miRNA的关系提供了有效的数据支持。