170株肠道门诊来源副溶血性弧菌特征分析

朱玲 强鑫华 嵇龙飞

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一种广泛分布在近海岸海水、海产品及腌制食品中的革兰染色阴性嗜盐杆菌，是引起食源性腹泻的重要病原菌之一，是沿海城市食物中毒和夏秋季腹泻疾病的主要病原菌［1］。有研究报道，由该菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的比例高达60%以上，居微生物性爆发病原的第一位［2］。自1996年首次爆发群体食物中毒事件以来［3］，VP的感染也升级为全球性公共卫生问题。VP在临床上主要是引起急性胃肠炎，另外还有伤口感染甚至菌血症。VP的毒力机制复杂，目前大量研究表明，主要是由多种毒力基因编码导致。另外，由于抗菌药物的不合理使用，VP对常规抗菌药的耐药率也在逐年升高［4］。本资料对湖州哨点医院肠道门诊来源的VP进行毒力基因（tdh、trh、tlh）检测，O、K血清分型以及抗生素耐药性试验，以了解本地区VP的流行特征，为临床和疾控防治提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 菌株 收集2015年1月至2019年12月本院肠道门诊就诊的腹泻患者，大便≥3次/d，粪便性状异常（呈稀便、水样便、黏脓便或脓血便等），每人留取粪便标本1份送本院微生物实验室，培养所得VP用甘油肉汤冻存于本院微生物室-80℃冰箱，共计170株，备用。

1.2 方法 （1）菌种鉴定：致病菌的检测方法菌株分离培养根据《浙江省食源性致病菌监测工作手册》进行，细菌菌种鉴定采用梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪鉴定到种，仪器及配套试剂购自法国生物梅里埃公司。（2）毒力基因检测：采用热裂解法提取细菌DNA：挑取火柴头大小菌落溶于500μl灭菌水中，振荡10s，100℃金属浴10min，13,000r/min 4℃离心10min，上清液即为模板DNA。单重PCR（聚合酶链反应）进行tdh、trh、tlh基因检测。所有引物由上海生工股份有限公司合成，引物序列及大小见表1。反应体系：25μl体系，其中引物（2对，浓度为10μmol/L）各 0.5μl，模板 DNA3μl，Taq 酶 12.5μl，用灭菌水补足至25μl。扩增程序：94℃预变性5min，94℃ 45s，55℃ 60s，72℃ 1min，30循环，72℃终延伸10min。取5μl扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察是否有对应长度的扩增条带。（3）血清凝集：将收集的VP进行O、K抗原的血清凝集，试剂购自日本株式会社，操作按照试剂说明进行，有效期内使用。（4）药敏试验：采用世界卫生组织（WHO）推荐的K-B纸片法进行药敏试验，结合美国临床与实验室标准委员会CLSI推荐，选取8类20种抗生素进行药敏试验，以ATCC25922为质控菌株，药敏纸片购自英国OXOID公司，有效期内使用，结果判读依据CLSI M452017版药敏准则进行。

表1 VP PCR检测目的基因引物序列

2 结果

2.1 一般数据结果 本资料所分离的170株VP中，2015年分离44株，2016年分离42株，2017年分离31株，2018年分离30株，2019年分离23株，其中男性来源70株，女性来源100株。

2.2 毒力基因检测结果 170株VP均携带tlh基因，166株携带tdh基因，未检测到携带trh基因。部分PCR产物鉴定结果见图1、2。

图1 部分菌株tdh基因PCR产物鉴定结果（DL 100 DNA Marker）

图2 部分菌株tlh基因PCR产物鉴定结果（DL100 DNA Marker）

2.3 血清凝集 O血清凝集试验，O3型最多，为121株（71.1%），其次为O4型，45株（26.5%）。K血清凝集试验，K6型最多，79株（46.5%），部分菌株O、K不凝集，血清学结果以及毒力基因结果见表2。

表2 血清分型与毒力基因携带结果

2.4 药敏试验结果 170株VP对AMP、KZ、PRL、AK、CN耐药率较高，分别为100.00%、96.10%、75.00%、58.18%、32.73%，对C、LEV、AMC、SAM、CAZ、CTX、FOX敏 感 率 较 高， 分 别 为98.00%、95.06%、94.18%、94.18%、93.80%、93.80%、92.73%，所有菌株对TZP、FEP、IPM、MEM、CIP、SXT、TE均100.00%敏感。见表3。

表3 170株VP药敏结果（%）

3 讨论

VP的主要致病作用是其可产生溶血毒素，包括耐热直接溶血素（thermostabledi rect hemoly sin，TDH）、耐热直接溶血素相关溶血素（TDH related hemolysin，TRH）和不耐热溶血素（thermolabile hemolysin，TLH），这三种溶血素分别由tdh、trh、tlh三种基因编码［5］。其中TDH是致病性VP产生的不含糖或脂质的蛋白质，可表现出溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性等生物学活性［6］。研究表明［5］TDH是VP重要的致病因子，临床分离株＞90%为TDH阳性株，而本资料发现，所有分离所得的170株VP携带率为97.6%（166/170），与其他地区检测数据类似。TRH可引起细胞外Ca2+浓度的增加，从而导致Cl-分泌增多引起腹泻，有研究表明，TRH与TDH氨基酸序列同源性高达67%。本研究收集所有VP，均未检测到有trh基因的菌株，这点与国内其他城市报道的情况有所区别［7-10］，具有湖州地区的特异性。TLH与TRH相反，在所有的VP中均有检出，这与报道的文献［5］一致，因为编码TLH的tlh基因具有种属特异性，不论菌株来自环境还是来自腹泻患者，均携带该基因。除外上述三种毒力基因外，目前还有研究报道T3SS、T6SS分泌系统的基因［11］，这一部分，本地区菌株还有待进一步研究。

VP血清型迄今为止有13个O抗原群和79个K抗原型组合而成的O∶K血清型，湖州地区以O3：K6型为最多，表明O3：K6是主要流行菌株。而且本地区所有的O3：K6菌株均携带tdh基因。本资料也发现，K血清型凝集结果不理想，大部分菌株存在凝集不出的情况，说明该菌血清型具有多样性，接下去的研究可以试着用分子分型的方法来确定K血清型。

本研究参照CLSI-M45标准，选取了青霉素类、头孢类、碳青霉烯类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、叶酸合成抑制剂八大类共20种抗菌药物，对收集的170株VP进行药敏试验。所得数据结果表明，湖州地区VP对抗生素的敏感性还比较高，大部分抗生素的敏感率＞90%，对TZP、FEP、IPM、MEM、CIP、SXT、TE未出现耐药情况，对AMP、KZ的耐药率较高，分析原因，可能与湖州水产养殖抗生素滥用有关，水产养殖户为了保障产量，对水产进行大量预防性用药，而用的最多的就是青霉素类，因此，应该加强对水产养殖抗生素的管理，以免造成VP耐药率上升，出现耐药菌株，给临床治疗带来一定的难度。虽然本地区总体抗生素耐药率不高，但也出现了对三类抗生素都耐药的菌株，应该引起重视，临床治疗时应该合理选用抗生素，防止耐药率的上升。