罕见病NGLY 1型先天性去糖基化障碍CDDG的临床和基础研究进展

袁舒颖 邹琳 库尔班江·阿布都西库尔 王建设 陈力 孙桂芹

作者单位：310053 浙江中医药大学医学技术学院（袁舒颖 孙桂芹）200032 复旦大学基础医学院病原生物学系，医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室（邹琳 陈力）201102 复旦大学附属儿科医院（库尔班江·阿布都西库尔 王建设）

Need等［1］于2012年发现，由NGLY1基因突变导致的N-糖苷酶缺陷，会引起一种新的糖基化障碍（congenital disorder of glycosylation，CDG）。后续的研究发现，该病为常染色体隐性遗传性疾病［1-4］，又命名为NGLY1型先天性去糖基化障碍（NGLY1-related congenital disorder of deglycosylation， 简 写 为 NGLY1-CDDG）［4］。NGLY1（N-glycanase 1,又称为Peptide：N-glycanase，PNGase）是一种专一的水解酶，作用于N-糖肽或N-糖蛋白的天冬酰胺（Asn）残基与N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）之间的酰胺键，生成含有天冬氨酸（Asp）的多肽链和游离的N-糖链，达到切除糖蛋白或者糖肽上N-糖链的目的，完成N-糖蛋白的去糖基化［5-6］。NGLY1的同工酶在酵母、线虫、果蝇、鱼、小鼠、拟南芥、植物等真核生物中分布广泛［7］；在原核生物中罕见，仅在脑膜炎败血伊丽莎白金菌（Elizabethkingia meningoseptica，又称为脑膜炎脓毒黄杆菌，Flavobacterium meningosepticum）中发现［7-8］。目前，NGLY1的生物学功能尚在研究中。研究表明，细胞内蛋白合成过程中，NGLY1在错误折叠N-糖蛋白的降解中起到关键作用，NGLY1缺陷可导致N-糖蛋白在细胞内累积，这可能是NGLY1-CDDG患者出现各种临床表现的原因［9］。

1 NGLY1-CDDG的临床研究

NGLY1-CDDG是一种特殊的CDG。真核细胞的蛋白质和脂质可通过糖基化修饰，调节其结构和功能、改善其稳定性和动力学。细胞内糖基化修饰系统由300多种不同功能的蛋白组成，糖基转移酶、糖基修饰糖苷酶，以及位于细胞胞浆、内质网和高尔基体中的转运蛋白等。胞内糖基化修饰发生异常，会导致一系列改变，引起疾病。1980年，比利时儿科医师Jaeken首次报道先天性糖基化障碍（CDG）［10］。CDG主要是由常染色体隐性遗传引起的罕见遗传代谢性疾病，也包括常染色体显性遗传（EXT1-CDG，EXT2-CDG等）以及伴X性染色体遗传（SLC35A2-CDG，SSR4-CDG等）引起的先天性糖基化障碍［11］。CDG根据糖基化缺陷类型可以分为N-糖基化缺陷、O-糖基化缺陷、糖磷脂和糖基磷脂酰肌醇锚定糖基化缺陷以及多种糖基化途径缺陷。目前，已知的CDG类型近130种，其中约有70种N-糖基化缺陷。NGLY1-CDDG是由于N-糖苷酶NGLY1缺陷导致的去糖基化障碍，属于N-糖基化缺陷的一种。NGLY1-CDDG也是一种常染色体隐性遗传的CDG［12］。

1.1 NGLY1-CDDG的病例报道 2012年发现全球首例NGLY1-CDDG患者。美国杜克大学医学院人类基因组变异中心的Need等［1］首次报道了1例欧美混血NGLY1基因突变患者（3岁，男性），其临床表现为发育迟缓、癫痫、肝功能异常、无泪、不自主运动等；基因检测发现，该患者NGLY1基因分别存在移码突变和无义突变；其血清中基本检测不到N-糖苷酶NGLY1蛋白。2014年Might和Wilsey［2］报道了4岁男孩患者Bertrand Might的染色体NGLY1基因突变，确定NGLY1缺陷为一种新型罕见遗传性疾病。2020年首次报道了亚洲前6例NGLY1-CDDG患者［13］。目前，全球共报道NGLY1-CDDG患者69例［9，13］，患者年龄范围从新生儿到21岁［3，13］，共发现30种不同的NGLY1基因突变。

1.2 NGLY1-CDDG的临床表现 NGLY1-CDDG患者主要有发育迟缓、智力缺陷、无泪少汗、肝功能异常及运动功能障碍等临床症状。（1）生长发育异常：大多患者刚出生时，身高体重符合正常标准，随后会出现发育不良（手小脚小、小头畸形、智力发育障碍、不能正常说话和行走等）的情况；存在肌肉骨骼异常（骨密度降低、复发性骨折、脊柱侧凸等）［1，3］。（2）神经系统异常：癫痫（主要表现为肌阵挛性癫痫），不自主运动（舞蹈症、肌强直、动作震颤等），轻度至重度的阻塞性和（或）中枢性睡眠呼吸暂停，听力障碍，进食困难（吞咽反应延迟、舌头运动障碍等），便秘［2，13］。（3）肝功能异常：新生儿黄疸，转氨酶（丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶）升高，肝硬化，肝纤维化，肝活检肝细胞中有无定型的物质存在［12-13］。（4）眼部异常：泪液分泌异常（泪少、干眼症），斜视，上眼睑下垂，眼距过长，角膜炎，视神经萎缩，视网膜色素改变（色素颗粒和色素视网膜病变），锥体发育不良［3］。（5）肾上腺异常：原发性肾上腺功能不全（可能由于蛋白稳态的破坏导致）［14］。（6）免疫系统：NGLY1-CDDG患者受到病毒感染的概率下降，但少数复发性严重呼吸道感染患者除外［4］。Yang等［15］研究发现，NGLY1敲除的人单核细胞THP-1内干扰素刺激基因（ISGs）表达上调，激活机体固有免疫信号，抵抗病毒感染。

1.3 NGLY1-CDDG的临床诊断 NGLY1-CDDG与其他遗传性疾病的临床表现相似，对机体产生系统性影响，缺乏特征性临床症状，主要依靠全基因组和全外显子基因测序才能确诊。（1）常规检查：①生长发育情况（NGLY1-CDDG患者表现发育迟缓，身高、体重、头围低于同龄平均水平，认知缺陷，不能正常行走，骨骼发育不良［3，12］）；②神经系统检查（NGLY1-CDDG患者表现癫痫、不自主的运动，针极肌电图显示不同程度的神经源性改变［3-4］）；③头颅磁共振扫描（NGLY1-CDDG患者有脑部萎缩现象［9］）；④脑电图检测（NGLY1-CDDG患者表现出广泛异常［3］）；⑤肝功能（NGLY1-CDDG 患者表现肝转氨酶升高［3，9］）。（2）特殊实验室检查：①血清转铁蛋白（transferrin，TF）等电聚焦电泳（糖基化障碍患者必筛项目，但NGLY1-CDDG患者一般表现为正常或轻度异常［1］）；②肝脏活检（NGLY1-CDDG患者肝细胞中存在不定型物质［1，12］）；③脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）实验室检查（NGLY1-CDDG患者总蛋白减低、脑脊液/血清白蛋白比率减低、脑脊液5-羟基吲哚乙酸、香草酸、四氢生物蝶呤水平减低［4］）；④血清N-聚糖检测［1］。（3）基因检测：由于NGLY1-CDDG患者缺乏特异性临床表现，符合上述检查结果，考虑遗传性疾病应开展患者、父母及兄弟姐妹的全基因组或全外显子基因测序，并分析其NGLY1基因是否出现突变。（4）NGLY1蛋白表达及酶活性检测：基因检测结果显示NGLY1突变，可同时检测其血清蛋白表达水平及酶活性。He等［16］对9例NGLY1-CDDG患者成纤维细胞中NGLY1的功能进行了检测，研究发现患者细胞对转染的N-糖蛋白ddVenus的去糖基化能力明显降低，表明NGLY1缺陷可导致其糖苷酶活性减弱。作者于2020年建立了NGLY1突变体的酶活性的体外检测方法。

2 NGLY1与疾病的相关研究

2.1 NGLY1的结构和去糖基化功能 蛋白质N-糖基化是真核生物最常见的一种翻译后修饰，参与维持N-糖蛋白的结构与功能。N-糖苷酶NGLY1参与清除细胞内错误折叠的N-糖蛋白，能完整切割糖蛋白或者糖肽上的N-糖链［5-6］。（1）NGLY1的结构：编码N-糖苷酶NGLY1的基因（NGLY1）定位于3号染色体3p24.2，长度约70 kb，含有12个外显子（见图1A），蛋白质全长为654个氨基酸［17］。人NGLY1中，有三个保守结构域：PUB（PNGase- and ubiquitin-related）、PNG Core、PAW（PNGase and other worm proteins）（ 见 图1B）［18］。PUB是蛋白与蛋白相互作用的区域（见图1D）；PAW参与NGLY1与寡糖的结合；PNG Core是NGLY1核心区域，催化N-糖蛋白的去糖基化［5］，该区域物种间高度保守，其中包括与我们前期发现细菌来源PNGase F-II的晶体结构相似［8］。临床已报道患者NGLY1基因发生突变的主要区域是PNG Core。目前，NGLY1的晶体结构尚未被解析，但是Srinivasan等［6］依据NGLY1的氨基酸序列，通过软件模拟了NGLY1的三维结构（见图1C）。Allen等［19］通过基因克隆表达NGLY1的PUB部分，解析了PUB的晶体结构（见图1D），该结构域由5个α-螺旋和3个反平行的β-折叠组成。（2）NGLY1的去糖基化功能：NGLY1通过切割N-连接糖蛋白的β-天冬酰胺键后释放完整的N-聚糖，催化蛋白质去糖基作用［18］。NGLY1裂解N-连接糖肽或糖蛋白上天冬酰胺（Asn）残基与N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）之间的酰胺键，生成含有天冬氨酸（Asp）的多肽链和N-糖链［20］。Srinivasan等［6］对纯化的NGLY1蛋白进行热稳定性检测发现，随着温度的升高，稳定性会出现两次明显的改变，第一次转折点约38℃，第二次转折点约52℃，这可能是由于NGLY1具有三个结构域，不同结构域的热稳定性不同。小鼠来源的PNGase，最适反应温度为30℃，最适pH是7.0，金属离子Zn2+、Cu2+、Fe3+对其酶活性有抑制作用［21］。PNGase具有较广的底物特异性，能够水解所有具有高甘露糖型、杂交型和复杂型的结构多样的天然糖肽底物，然而，不作用于N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）［21］。目前，用于体外分析NGLY1去糖基化能力的底物主要是核糖核酸酶B（RNase B）［20］。研究发现，NGLY1主要作用于高甘露糖型N-糖蛋白［22］，内质网中最先合成的含有N-聚糖的多肽链上，共有11个糖，其中9个为甘露糖，因此，甘露糖含量高的N-聚糖链，可以作为早期蛋白质量控制的靶标［3］。

图1 NGLY1的结构（A:人NGLY1基因外显子之间的间距。蓝色竖线:NGLY1基因中的12个外显子，橘色横线:NGLY1基因中的内含子［17］。B:NGLY1结构域。PUB:与p97蛋白相互作用的位点；PNG Core:PNGase核心催化区；PAW:高甘露糖型聚糖的结合域［18］。C:NGLY1模拟三维结构图［6］。D:PUB结构域的三维晶体结构图［19］）

2.2 NGLY1的生理及病理功能研究 （1）NGLY1在人体不同组织的表达：THE HUMAN PROTEIN ATLAS网站（https：//www.proteinatlas.org），从144个正常人中获取45种不同的正常组织样本，通过组织微阵列和免疫组化方法检测了NGLY1蛋白表达情况。根据样本染色强度，对其表达水平进行划分。结果显示NGLY1蛋白在人体的肾上腺、胃、肝脏、精囊、输卵管等20种部位高表达；在大脑皮层、小脑、骨骼肌、淋巴结等16种部位中表达；在海马体、食道、卵巢、子宫、骨髓部位低表达；在口腔黏膜、阴道、脂肪组织、皮肤四个组织未检测到表达（口腔黏膜、阴道、皮肤存在大量脱落细胞，推测凋亡细胞中NGLY1低表达或不表达）。根据THE HUMAN PROTEIN ATLAS网站数据分析结果显示了64种细胞系、37种人体组织和18种血细胞类型以及外周血单核细胞（PBMC）中编码基因RNA表达情况。睾丸、树突状细胞、NK细胞、B淋巴细胞、粒细胞内表达水平较高。免疫细胞中NGLY1的RNA高表达，推测NGLY1可能与机体免疫功能相关。综合上述数据，NGLY1蛋白及其RNA水平均高表达的是睾丸；两者均低表达的是卵巢、骨髓、食道；蛋白高表达而RNA低表达见于肝脏、骨骼肌、胰腺、唾液腺、精囊；在皮肤和脂肪组织中检测到RNA，但未见蛋白表达。产生上述情况的原因，有待研究。分析来自216例癌症患者的20种不同癌症组织样本的NGLY1蛋白表达情况。结果显示NGLY1在＞90%的胰腺类癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、睾丸癌、子宫内膜癌、乳腺癌等8种癌症组织NGLY1蛋白呈中或高表达水平，在36%的皮肤癌、33%的肺癌是中或高表达；并同时分析17种癌症组织中NGLY1的RNA表达情况，结果显示较低的癌症特异性。（2）NGLY1参与ERAD途径：蛋白内质网合成过程后，正确折叠组装的蛋白，通过囊泡运输至特定细胞器。错误折叠组装的蛋白，从内质网中逆转运至细胞质，在蛋白酶体中降解，这一过程称为内质网相关降解途径（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）［18］。研究报道［18］，NGLY1 参与 ERAD途径，在糖蛋白质量控制、细胞功能等方面发挥重要的作用。Fujikawa等［23］发现，内质网凝集素检测到错误折叠的糖蛋白后，介导错误折叠的糖蛋白从内质网转移至细胞质中。Suzuki等［5］认为NGLY1作用于错误折叠的糖蛋白，使其脱糖后，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶（endo-β-N-acetylglucosaminidase，ENGase）及溶酶体等对自由糖链进行降解，蛋白酶体对多肽链进行降解。NGLY1的PUB结构域，能与ATP酶p97结合［19］，与细胞凋亡蛋白FAF1（Fas-Associated Factor 1）形成复合体。且p97、FAF1与PUB的结合可能存在竞争，推测PUB与FAF1结合后，可能通过ERAD途径进行蛋白降解。Tickotsky等［24］分析人体内FAF1与NGLY1的比例显示，骨骼肌和脑组织中比例最高，超过3∶1。上述研究结果提示，NGLY1缺陷可能会影响骨骼肌和脑组织细胞功能，从而部分解释NGLY1-CDDG患者表现为神经系统和肌肉骨骼异常的原因。（3）NGLY1参与生长发育：Fujihira等［22］观察到，C57BL/6 Ngly1+/-缺陷的雌雄小鼠配交后，无法产生Ngly1-/-的后代。在胚胎发育过程出现室间隔缺损现象，是可能发生胚胎致死的原因之一。果蝇NGLY1同源基因Pngl与骨骼形态生成蛋白（BMP，bone morphogenetic protein）信号通路有关，参与果蝇胚胎期消化道的形成，该基因缺陷会导致幼虫消化道畸形［25］。Habibi-Babadi等［26］研究发现，秀丽线虫中NGLY1的同源基因png-1与神经系统发育相关，png-1可以通过神经元和上皮细胞，限制轴突分支，而png-1缺陷的秀丽线虫，其产卵器官发育过程中出现轴突分支增加，导致产卵行为异常。根据以上研究可推测NGLY1缺陷可能是患者出现生长发育迟缓的主要原因。（4）NGLY1维持线粒体正常功能：Kong等［27］发现两例NGLY1-CDDG儿童肌肉和肝脏细胞内线粒体数量和功能发生改变，NGLY1缺陷导致细胞内线粒体数量下降、膜电位受损、氧化呼吸能力下降等，影响线粒体正常生理功能，降低人肺成纤维细胞的存活率。这一研究显示，NGLY1参与维持细胞内线粒体的正常功能。（5）NGLY1与抗原提呈：主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）I类分子通过提呈抗原肽激活淋巴细胞，在识别胞内病原体中起重要作用［28］。MHC I类分子含有一个N-聚糖的重链（heavy chain，HC）、可溶性轻链（β2微球蛋白），在内质网中通过结合8～10个残基的抗原肽，进入分泌途径，提呈于细胞表面，可被CTL识别，进行杀伤［28］。研究提示，在一定条件下，NGLY1可以参与细胞内抗原提呈。某些病毒通过抑制MHC I类分子在细胞表面的表达，逃避免疫系统的攻击。Blom等［28］报道人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）可以表达 US2（unique short domain 2）和US11（unique short domain 11）两种蛋白，这两种蛋白可以与MHC I类分子结合，将重链转移至细胞质内，重链上的N-糖链被NGLY1去糖基化，随后将其降解，抑制抗原提呈，逃避免疫系统的攻击。（6）NGLY1与肿瘤：NGLY1在某些肿瘤细胞中高表达，如黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞。Zolekar等［29］对黑色素瘤细胞进行研究发现，与人类正常黑色素细胞相比，黑色素瘤细胞NGLY1表达水平上调。NGLY1抑制剂对黑色素瘤细胞有明显抑制作用，但对正常细胞无影响，提示NGLY1可作为治疗黑色素瘤的新靶标。有研究结果提示，NGLY1可能有利于细胞毒性T淋巴细胞CTL对癌细胞的识别。Skipper等［30］研究发现，与抗原肽（Asn）相比，抗原肽（Asp）对酪氨酸酶特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）更敏感。Suzuki等［17］认为，NGLY1催化的去糖基化作用可能参与从酪氨酸酶中提取黑色素瘤特异性抗原肽的过程。酪氨酸酶在NGLY1作用下，发生去糖基化，所产生的抗原肽上有一个氨基酸发生改变，由天冬酰胺（Asn）变为天冬氨酸（Asp）。

3 展望

NGLY1-CDDG是一种罕见的常染色体隐性遗传病，该疾病的相关研究仍处于起步阶段。研究表明，NGLY1与体内多种生理功能相关，如糖蛋白的降解、机体的正常发育、线粒体的正常功能、抗原提呈及肿瘤发生等密切相关，但NGLY1缺陷所致疾病的机制尚未完全明确。NGLY1-CDDG的临床和基础研究亟待加强。

加强NGLY1发病机制的研究，如特定基因突变对NGLY1表达降低、酶活性异常、NGLY1在人体发育过程的功能等方面相关基础性研究。提高临床诊断效率，对NGLY1-CDDG的诊断主要依据NGLY1基因突变检测，还需进一步分析基因突变对NGLY1酶活功能的影响，可以帮助我们快速识别特定突变位点的临床意义。在前期研究中作者建立了NGLY1体外酶活功能快速检测方法，发现R328位氨基酸（精氨酸）突变会导致其酶活功能降低［13］。临床对出现NGLY1-CDDG类似临床症状但病因不明的患者，应开展全基因组和全外显子测序，并同时检测NGLY1的酶活性，提高检测的准确度，为NGLY1-CDDG的诊断提供更充分的数据，尤其在产前筛查和新生儿疾病筛查领域有潜在应用前景。

（说明：袁舒颖、邹琳、库尔班江·阿布都西库尔三位作者以及王建设、陈力、孙桂芹三位作者分别对文章做出了相同贡献。）