非优质胚培养至第7天囊胚冻融移植成功获得活产1例

屈春凤，莫凤明，韦霁芸，班婷

(河池市人民医院生殖医学中心，河池 547000)

一、病例资料

女方，33 岁，2019年3月因继发性不孕11年到我中心就诊。患者自诉2004年足月顺产1女，产后3个月放置宫内节育器避孕；2008年行取环术，术后月经规律，性生活正常，未避孕，但一直未孕。就诊时，体质量指数26.7 kg/m2，基础FSH 7.41 U/L，LH 5.79 U/L，AMH 6.32 ng/ml，B超监测排卵正常。2019年5月行子宫输卵管造影提示双侧输卵管通畅，染色体核型分析为46，XX，无基础疾病，无不良孕史。

男方，38岁，2019年3月行精液检查结果为精液量2.2 ml，精子浓度16.4×106/ml，精子活动率54.1%，前向运动精子率32.5%，正常形态精子率4%。2019年4月再次行精液检查结果为精液量4.8 ml，精子浓度7.8×106/ml，精子活动率47.2%，前向运动精子率31.0%，正常形态精子率4%。两次结果均提示为少弱精子症，无烟酒嗜好，无基础疾病史，染色体核型分析为 46，XY。

夫妇双方曾于2019年7月在我院行第一周期人工授精助孕，精液处理后前向运动精子总数未达标(<10×106/ml)，患者及家属签字要求继续行人工授精手术，但未孕。2019年8月在我院行第2周期人工授精助孕，精液处理后仍不达标，取消人工授精周期。于2019年10月转体外受精-胚胎移植技术助孕，采用短效长方案进行降调节，注射用尿促卵泡素(珠海丽珠制药)进行促排卵，2019年10月16日在阴道超声引导下穿刺获得5枚卵母细胞。取卵当天男方采用手淫法取精，将密度梯度离心法处理后的精子用于体外受精。体外受精4 h后，根据脱颗粒细胞第二极体出现情况进行成熟和受精判断，发现5枚卵母细胞均为成熟卵母细胞(MⅡ)，立即对未受精的成熟卵母细胞行卵胞浆内单精子注射(ICSI)，获得4枚正常受精卵。培养至第3天获得2枚优质胚胎(8Ⅱ级胚胎)和2枚非优质胚胎(1枚5Ⅲ级，1枚4Ⅲ级)，新鲜移植 2 枚(8Ⅱ级)胚胎，剩余1枚5Ⅲ级和1枚4Ⅲ级进行囊胚培养。培养第5天未形成囊胚，第6天形成1枚I期囊胚，延长培养至第7天形成1枚4BC 囊胚，采用商品化玻璃化冷冻试剂及载体(KITAZATO，日本)，予以冷冻保存。

胚胎评分：卵裂期胚胎评级根据卵裂球数目、碎片、卵裂球的均匀程度等情况评估胚胎质量，第3天卵裂期胚胎细胞数为7～9个、碎片比例不超过20%的Ⅰ级和Ⅱ级胚胎为优质胚胎。囊胚评分参照 Gardner 评分系统[1]，第5～6天≥3BB评为优质囊胚，第5～7天≥3BC评为可用囊胚。

冻融胚胎移植患者内膜准备：新鲜移植失败后，患者于2020年1月回我院行冻融囊胚移植。月经周期第2天行B超监测内膜，口服戊酸雌二醇片(拜耳，德国)2.0 mg/次，2次/d，6 d后增至6 mg/d，再6 d后增至8 mg/d；第17天开始肌注黄体酮(天津金耀药业)60 mg/次，1次/d进行内膜转化，内膜转化第7天进行解冻囊胚移植。

复苏移植：采用商品化玻璃化解冻试剂(KITAZATO，日本)进行胚胎复苏。对解冻囊胚行透明带激光打孔辅助孵化，于37℃、三气培养箱内培养2 h，待囊腔扩张后移植。移植后口服14 d戊酸雌二醇片(拜耳药业，德国)8 mg/d和雪诺酮(默克公司，英国)90 mg/d。第14天抽血查人绒毛膜促性腺激素为 1 746 U/L；第35天进行B超超声检查单胎妊娠，可见胎芽、卵黄囊及原始心血管搏动。孕42周时，顺产一女婴，体重3 600 g，婴儿生命体征正常，新生儿评分9分。

二、讨论

随着囊胚体外培养体系的不断优化，囊胚培养作为一种对胚胎发育潜能进一步筛选的方法，已被广泛应用于临床。大多数胚胎培养室常规将胚胎观察培养至第5～6天，很少培养至第7天再利用。延长胚胎体外培养时间，虽然可淘汰没有发育潜能或携带异常染色体和基因的胚胎，但也存在胚胎质量下降的可能性。D7囊胚形成率低，其质量不如D5、D6囊胚，且在冷冻过程中容易受到损伤，增加细胞DNA碎片量、促进凋亡基因转录，从而降低其发育潜能[2]。研究发现，胚胎在体外培养至第5～6天的囊胚形成率约为67%，培养至第7天的囊胚形成率仅为29%[3]。Hammond等[4]研究表明，体外培养至第5天、第6天和第7天的可用囊胚率分别为 65%、30%和5%，且仅少数患者在第7天有可用囊胚形成。目前多数学者认为，D5囊胚移植比D6囊胚移植可以获得更高的临床妊娠率及活产率[5-9]。郭娜等[10]研究发现，分别移植了D5囊胚、D6囊胚和D7囊胚的患者，其临床妊娠率分别为60.81%、50.12%和29.17%，活产率分别为 50.69%、39.23%和18.75%。尽管与D5囊胚和D6囊胚相比，D7囊胚形成率较低，但进一步延长体外培养时间可以让囊胚有更多被选择的机会。Du等[11]研究发现，移植了15例整倍体D7囊胚，最终2例成功分娩，新生儿评分良好。最近，阮秋燕等[12]报道了1例冻融移植由第3天优质胚胎培养至第7天的囊胚，成功获得活产的案例。本文报道的该例患者是冻融移植由第3天非优质胚胎(<6细胞Ⅲ级胚)培养至第7天的可用囊胚，最终成功单胎妊娠，顺利分娩一名健康婴儿。这说明将第3天发育迟缓、胚胎质量差的卵裂期胚胎延长培养至第7天再进行冻融移植，仍然可以获得临床妊娠和活产的机会。

近年来，利用植入前胚胎遗传学非整倍体检测(PGT-A)技术分析胚胎非整倍体性发现，发育缓慢的胚胎具有较高的非整倍体率。Su等[13]对1 966枚囊胚进行活检分析，发现D7囊胚中63.3%存在染色体异常。既往研究也发现，囊胚的非整倍体率与囊胚发育速度具有相关性，随着囊胚形成天数的增加其非整倍体率也随之增高[14-15]。Whitney等[16]发现，与移植D5囊胚相比较，移植D7囊胚的患者流产率显著升高，活产率显著降低。然而Hiraoka等[17]比较了分别冻融移植D5、D6、D7囊胚的出生结局发现，三组的孕周、早产率和平均出生体重均无显著差异，故认为不同天数形成的囊胚移植后可获得相似的发育潜能。Du等[11]报道，与D5囊胚相比，冻融移植D7囊胚的活产率下降，但新生儿身体质量、畸形发生率和新生儿死亡率均无显著差异。因此，这对于部分自身条件差、获得可用胚胎较少且胚胎质量差、不能耐受再次IVF助孕的患者而言，将胚胎延长培养至第6天，可能是一种合适的策略，特别是在发育迟缓的情况下，可以继续培养至第6天甚至第7天。但此类培养至第7天形成的囊胚面临较高流产率的风险，其临床应用的可行性和安全性存在较大争议[13]。在利用这类胚胎进行冻融移植时，应和患者充分沟通，说明利弊关系。

选择利用D7囊胚的 IVF患者仅占很小一部分，对此类囊胚移植临床结局的报道也较少，虽然可以获得临床妊娠及活产机会，但其应用价值和安全性尚存在争议，需要长期跟踪随访后代健康来证实。