世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册(第6版)》简介

卢文红，谷翊群*，贾孟春，周芳

(1.国家卫生健康委科学技术研究所/WHO人类生殖研究合作中心(北京)，北京 100081；2.国家卫生健康委男性生殖健康重点实验室，北京 100081)

世界卫生组织(WHO)《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》于1980年首次出版，以满足临床与科研对人类精液标准化检测程序日益增长的需求。该手册是人类精液实验室检查和处理程序及方法的标准操作指南，旨在提高精液分析的质量和提高不同实验室结果的可比性。

在过去40年里，该手册进行了4次修订与补充(1987年、1992年、1999年和2010年)，内容涉及精液检查的标准化操作程序、精子功能、精浆生化、精液处理与冷冻以及质量保证等，已成为国际公认的标准，被世界各地临床和实验室广泛使用。中国卫生部已在2003年将其纳入人类辅助生殖技术规范。

WHO《人类精液检查与处理实验室手册(第5版)》精液参考值的数据是来自全球3大洲8个国家的前瞻性、多中心临床研究的结果，通过循证医学研究获得的精液参数参考值具有里程碑式意义。自2010年出版以来成为WHO最受欢迎的出版物之一，即使在最近几年其下载量也在稳步增长。它是男科实验室及全球范围内开展精液分析操作的其他实验室、医院和研究机构使用的标准操作手册。该手册在国际大会、科学会议、以及WHO合作中心、专业学会和其他学术机构的培训项目中进行了广泛传播。截止到2021年，已被3 000余篇同行评议论文和评论引用。

国家卫生健康委科学技术研究所从1992年起至今，作为WHO人类生殖研究合作中心，一直肩负着引进与推广WHO相关技术标准与指南的职能，先后将手册的第3版、第4版、第5版引入国内，翻译成中文由人民卫生出版社正式出版发行，并在全国范围内长期进行精液分析标准化与质量控制的推广，受到我国生殖医学、男科学等领域及相关从业人员的广泛欢迎。手册供不应求，尤其第5版更是经历5次印刷，举办了60余期标准化与质控培训。

2021年7月WHO《人类精液检查与处理实验室手册(第6版)》一经问世，便得到了业内广泛关注。国家卫生健康委科学技术研究所和四川省人口和计划生育科学研究所作为WHO人类生殖研究合作中心获得了WHO授权，将其翻译成中文，并将由WHO出版合作中心人民卫生出版社出版发行。

一、《人类精液检查与处理实验室手册(第6版)》的变化

第6版手册由9章组成，包括精液检查(基本检查、扩展性检查、前沿性检查)、精子制备及冷冻保存、以及质量评估和质量控制等，删减、新增和扩展了部分章节。

1.基本检查：是确定精液变量稳定的常规方法，不仅是男科实验室，任何开展精液检查的实验室都能遵循。

精子计数依然推荐使用改良Neubauer血细胞计数板的方法，但计数的方法有了改变。明确推荐了伊红苯胺黑染色法作为精子存活率诊断的首选方法，伊红染色和低渗肿胀实验只作为备选方法。删减了参考值下限的描述。对于精子活动率大于40%的样本没有必要做存活率评估。与第5版手册中淡粉色判读为活精子不同，明确了只有精子头为白色的精子为活精子、淡粉色为死精子。

临床数据表明，鉴别快速前向运动精子非常重要。因此，关于精子活力分级，第6版手册建议恢复到快速前向运动、慢速前向运动、非前向运动和不活动4个活力级别，但精子活动率的参考值范围却依然是按前向运动(PR)、非前向运动(NP)、不活动(IM)3个活力级别计算。

第6版手册强调，精子形态学评估的价值不仅在于其可用于判断自然妊娠和辅助生殖技术(ART)结局的预后，还可以为男性生殖器官包括睾丸和附睾功能判断提供更多诊断信息。对于3%和5%的精子“正常”形态率的判断，则要求必须由训练有素的人员评估1 500个精子来完成；对于无尾精子(只有头部的精子)超过总精子数20%的精液，应单独计算并在报告中注明；新版本提供了精子形态学评估顺序图；使用其它染色方法进行精子形态学评估，需用本手册所描述的巴氏染色方法进行验证；更加强调了精子形态学分析的内部和外部质量控制以及在形态学分析时使用多键分类计数器。

2.扩展性检查：可以在某些情况下由实验室选择或根据临床医生的特殊要求而使用的项目。手册增加了精子DNA损伤、遗传学和炎症细胞等相关检查项目。提出了基因突变是导致不育和精液常规检查异常的原因。新增了精液相关细胞因子、趋化因子等检测的方法、试剂、检测步骤等内容。

在精液参数异常的男性中普遍存在精子DNA损伤，并且已有报道指出其与精液参数正常男性的不育有关。由于与精液质量相关，精子DNA损伤检测是男性不育检查中的重要补充内容，已成为男科学基础和临床中论述最多、最有前景的精子损伤分子标志物之一。本版手册增加了大量篇幅对其原理和检测方法进行了描述。

新增了基因和基因组测序内容。临床上，越来越多的人意识到染色体异常[数量异常、结构异常(包括微缺失和微重复)]和基因突变是导致各种男性不育症的基础病因，而这正是在精液分析中观察到的许多异常的原因。尽管基因和基因组测序常规在医学遗传学实验室进行，但一些男科实验室也在做同样的检测。

关于精液中未成熟生殖细胞的评估，WHO《人类精液及精子宫颈粘液相互作用检查实验室手册(第4版)》将精液中未成熟生殖细胞600万/毫升以上界定为异常，但因未找到该界限值的可靠证据基础，第6版建议不再将其作为参考值。

为明确生殖道炎症对于男性不育的影响，泌尿男科医生可能提出对精液中的趋化因子和细胞因子进行评估。本手册纳入了精液中白细胞介素检测方法。

3.前沿性检查：目前不作为生育力低下男性初步评估的常规方法。这一部分包括了非常专业化的、主要用于研究的方法和其他新兴检测技术。

有研究认为，氧化应激可能是影响人类精子功能和妊娠结局的重要因素；新的证据也表明了精子DNA完整性和染色质组装与生育力的关系。前沿性检查一节中详细介绍了精子氧化应激和活性氧实验、精子染色质检测(苯胺蓝和色霉素A3染色)的具体实验操作及讨论。

手册重写了计算机辅助精子分析(CASA)部分，强调了CASA对于检测精子浓度的局限性与质控要求，增加了CASA检测精子超活化运动的内容。

对精子跨膜离子流和转运的功能分析，可更好地了解男性不育因素和男性生殖器官疾病。为此，手册新增了检测精子跨膜离子流和转运的内容。

4.人类精子冷冻保存和储存：增加了冷冻样本的安全性、精液冷冻保存方案、快速液氮熏蒸冷冻、冷冻精液的解冻、玻璃化冷冻等内容，更具可操作性。本手册对人类精子的冷冻保存提出了具体建议：将样本分管分罐分开储存；对使用的材料和留存标本建立定期核验程序；所有储罐都应有液位监控报警系统，以监测温度和液氮液位，传感器应连接警报器，可通过实验室人员的终端进行提醒。

新证据表明，玻璃化冷冻是冷冻保存精液的一种有价值的方法。该方法的原理是将小体积样本与无污染液氮直接接触并快速冷冻，可以防止冰晶的形成，并减少精子的渗透性损伤。在麦管玻璃化冷冻(无菌玻璃化冷冻)中，也可以使用封闭系统，不需要无菌的液氮。

5.质量保证和质量控制：手册保留了质量保证和质量控制章节，对部分内容进行了修订，以使非统计专业人员更容易理解。

此外，因为一些检测技术不适宜临床使用，本手册删减了精子-卵母细胞相互作用试验、人卵透明带结合试验、去透明带仓鼠卵穿透试验及精子与宫颈粘液接触试验等方法。

二、关于精液参考值范围

前4版手册提供了传统人工检查精液的参考值范围与下限。在第5版手册中，采用妊娠等待时间(time to pregnancy，TTP)对12个月内使其性伴侣自然怀孕的男性最接近伴侣妊娠时点的精液(精液标本来自3大洲的8个国家，获得各个精液参数所使用的精液样本数不一致，400例～1 900例不等)检测结果的分布进行了统计，分布的第5个百分位点确定为可生育男性的精液参考值下限。数据来源于前瞻性多中心临床研究。

而第6版是在第5版研究数据的基础上，增加了来自中国、埃及、希腊、伊朗、意大利等国家2010年以后符合第5版手册中TTP研究纳入标准、自然怀孕时间在一年内(TTP为12个月之内)的同质性新数据(总数据量大约3 500例)进行了二次统计分析，计算出参考值范围与下限。本手册与第5版手册相比，精液参考值范围与下限变化不大，一些参数略有上下微调，表明在过去10年间在全球范围内精液参数没有出现明显变化趋势。

在过去的10年中WHO并没有在全球范围内牵头开展多中心临床研究，本手册获得的新数据与第5版数据收集年代不同，且有些数据的地域代表性有限。此外，由于精液检查的诸多不确定性以及生育和不育男性的精液参数存在重叠分布，本手册给出的精液参考值范围可作为临床男性不育治疗决策的参考，但应避免过度解读。

在此感谢同道们对《人类精液检查与处理实验室手册(第6版)》中译本的关注，欢迎大家对即将出版的中文译本的翻译内容提出宝贵意见。我们团队将会在后续的学术会议或系列培训中就一些技术问题进行深入解读，共同提高我国男科学及男性生殖医学实验室检测同质化水平。