卵母细胞体外成熟技术的改进策略

吴锐，黄官友，赵淑云

(贵州医科大学附属医院生殖医学中心，贵阳 550001)

辅助生殖技术(ART)是治疗不孕不育的主要方法，高质量的成熟卵母细胞是决定ART成功的关键因素之一。在不孕女性，特别是多囊卵巢综合征(PCOS)患者及卵巢低反应人群中，不成熟的卵母细胞较为多见，从而导致卵母细胞的利用率与ART的成功率大幅下降。为此，卵母细胞体外成熟(IVM)技术应运而生。IVM技术的应用不仅能提高卵母细胞的利用率，还有利于减少激素用量，降低过度刺激综合征的发生风险。此外，IVM技术在女性生育力保存方面具有较大的应用前景。

从首次利用IVM与ART技术相结合的试管婴儿成功诞生到2015年，全世界有超过2 000例的IVM试管婴儿[1-2]。临床数据显示，经IVM处理后的卵母细胞成熟率低，发育潜能差。PCOS患者未成熟卵进行IVM-IVF后其临床妊娠率与着床率显著低于采用常规IVF的PCOS患者[3]。因此，改善IVM技术、提高卵母细胞IVM成功率与卵母细胞质量具有十分重要的临床意义。本文就近年来对卵母细胞IVM进行改善的策略进行综述，以期为人卵母细胞IVM技术进一步完善、早日实现IVM技术在胚胎实验室中作为常规使用提供帮助。

一、抗氧化剂的使用

由活性氧(ROS)引起的氧化应激是导致卵母细胞IVM成功率低下的重要原因之一。在体内，卵母细胞的ROS水平相对稳定；而在体外，卵母细胞缺少卵泡液等类似于体液的调节，其ROS平衡容易受到破坏。同时，体外操作、光照及培养环境的改变都容易产生ROS，破环线粒体功能，从而降低卵母细胞质量。因此，在体外培养的培养液中添加抗氧化剂可以减少ROS，改善线粒体功能，从而提高卵母细胞的成熟率与发育潜能。

辅酶Q10是一种重要的抗氧化剂，也是线粒体呼吸链中关键的电子载体。Ma等[4]研究发现，高龄不孕女性的卵母细胞在进行体外培养时添加辅酶Q10，不仅提高了卵母细胞的体外成熟率，也降低了成熟卵母细胞的非整倍体率。白藜芦醇作为抗氧化剂，在改善高龄女性卵母细胞非整倍体与线粒体功能方面具有重要作用。一项关于白藜芦醇是否改善高龄妇女与小鼠卵母细胞IVM结局的研究发现，添加1.0 μmol/L白藜芦醇可显著提高人与小鼠卵母细胞IVM后的极体排除率(即核成熟率)，同时提高小鼠卵母细胞的受精率与囊胚形成率[5]。褪黑素作为自由基的清除剂，可保护细胞免受ROS造成的损伤。同时，褪黑素在延缓卵巢衰老、调节黄体酮产生与预测卵巢储备功能方面也发挥重要作用。在卵胞浆内单精子注射(ICSI)周期获取的GV期和MI期卵母细胞的培养液中分别加入1 nmol/L褪黑素，可以将IVM率分别提高至70%和90%[6]。进一步研究发现，利用褪黑素进行IVM所获得的卵母细胞具有较好的发育潜能；RNA测序发现，卵母细胞的氧化磷酸化通路相关基因的表达水平显著上调，线粒体膜电位与ROS水平也得到改善[7]。另有研究发现，卵母细胞IVM培养液中添加褪黑素可降低因卵泡液褪黑素不足所导致的高龄女性卵母细胞非整倍体率[8]。在绿茶中发现的抗癌物质茶多酚可有效清除氧自由基，有抗氧化作用。最新的研究发现，茶多酚在改善猪卵母细胞的体外成熟和胚胎发育方面亦有重要作用[9]。

此外，还有不少具有抗氧化和防衰老的抗氧化剂在癌症治疗和卵母细胞老化中已有研究，或可同样有利于卵母细胞的体外成熟。以上有关抗氧化剂的使用虽能有效促进卵母细胞IVM和胚胎发育，但其对后续胚胎着床与胚胎安全的影响仍需要更多的临床数据进行验证，临床使用仍需谨慎。

二、激素与生长因子的应用

FSH和LH是调控卵泡发生和减数分裂进程的两种重要激素。2007年，有研究发现添加FSH和LH有助于卵丘细胞的扩张和卵母细胞核成熟[10]。目前，大多数用于研究卵母细胞IVM的培养液都已添加FSH与LH，以期提高卵母细胞IVM率。

生长激素作为经典的多效性肽段激素，已有临床研究表明可用于治疗女性不孕。生长激素治疗可提高卵巢正常反应的不孕女性的胚胎种植率和受孕率，而对卵巢低反应、高龄或多次IVF周期失败的女性，生长激素治疗可提高已获取的卵母细胞的成熟比例、2PN率和可移植胚胎数[11-15]。体内注射生长激素还有助于提高人GV期卵母细胞的IVM率[16]。最近有研究发现，在IVM培养基中添加生长激素可提高卵母细胞IVM率；成熟卵母细胞进行ICSI后，受精率与囊胚形成率也显著升高；RNA测序发现添加生长激素组的成熟卵母细胞中与减数分裂和胚胎发育相关的基因表达水平都显著升高[17]。

LH下调卵母细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平是促使卵母细胞恢复减数分裂的关键。在卵巢卵泡内，LH并不直接作用于卵母细胞，而是通过C型钠尿肽/钠尿肽受体2(CNP/NPR2)系统与表皮生长因子(EGF)及其受体形成的信号通路降低卵母细胞内cAMP水平。EGF信号通路不仅参与LH信号传导，而且在颗粒细胞功能、卵丘-卵母细胞复合物代谢、卵母细胞成熟与发育潜能等多方面发挥重要作用[18]。卵母细胞IVM过程使EGF信号通路被破环，如果添加EGF样肽段(如AREG、EREG、BTC等)，则有助于改善卵丘细胞扩展、卵母细胞MⅡ率、卵裂率、囊胚形成率、囊胚内细胞团细胞数目以及囊胚着床率[18]。最近，在一项利用小鼠模型研究影响高龄女性卵母细胞质量的生长因子的研究中，科研人员发现胰岛素生长因子(IGF2)在老年小鼠卵泡和卵母细胞的表达水平都显著下降。但如果在卵母细胞IVM培养液中添加IGF2，则极大提高了卵母细胞的成熟率，改善了卵母细胞的纺锤体形成与线粒体功能，囊胚形成率也从41%提高至64%[19]。

三、卵泡液的使用

卵泡液是卵母细胞体内成熟的重要微环境。卵母细胞在减数分裂GV期的停滞及减数分裂的重启都与卵泡液密切相关。卵泡液中的物质，如cAMP、FSH等可以通过壁颗粒细胞转运至卵母细胞，维持卵母细胞内高水平的cAMP，抑制促成熟因子(MPF)的生物学活性，从而导致卵母细胞停滞在减数分裂GV期；随着卵泡液中LH峰的出现，卵母细胞与卵泡液中的环磷酸鸟苷(cGMP)水平降低，磷酸二酯酶活性升高，从而导致cAMP水平降低，减数分裂恢复[20]。另外，卵泡液成分或所占比重在原始卵泡激活、次级卵泡生长与卵母细胞成熟等不同阶段各不相同，优化各个阶段的卵泡液成分比例，有助于提高卵母细胞IVM率与卵母细胞质量。在卵泡激活与生长阶段，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)与mTOR复合物1(mTORC1)两条信号通路是主要的调控途径。使用激活剂激活mTOR或PI3K信号通路有助于改善早发性卵巢功能不全(POI)患者的ART治疗结局[21]。目前大多数研究都表明，卵母细胞与颗粒细胞的相互作用是卵泡激活与发育的关键。例如，在卵泡体外培养(IVC)系统中添加卵母细胞分泌的生长分化因子-9(GDF-9)或骨形态因子-15(BMP-15)可促进原始卵泡的激活[22]。在卵泡体外生长阶段添加200 ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可促进颗粒细胞增殖，抑制窦前卵泡的凋亡，从而有利于卵巢早期卵泡的发育[23]。

PCOS患者对激素调控的卵巢反应与其他不孕女性不同，容易出现卵巢过度刺激，且卵母细胞成熟率低、质量差，这可能与卵泡液成分含量变化相关。在一项PCOS女性卵母细胞IVM的研究中，研究人员比较了PCOS患者来源的未成熟卵母细胞在四个不同处理组的IVM结局：A组为直接IVM，B组为添加自身来源的卵泡液进行IVM，C组为添加正常卵泡液进行IVM，D组为添加正常卵泡液和卵丘颗粒细胞复合物进行IVM。卵母细胞IVM率依次为D组>C组>A组>B组，且D组的卵母细胞受精后卵裂率最高。此结果表明，添加优质卵泡液可改善卵母细胞的IVM率，而劣质的卵泡液会抑制卵母细胞的IVM[24]。

四、颗粒细胞的使用

颗粒细胞是卵泡内除卵母细胞外的主要细胞，包括卵泡边缘的壁颗粒细胞和包裹卵母细胞的卵丘细胞。颗粒细胞通过与卵母细胞的连接将卵泡液中的营养物质与生物信号传递到卵母细胞，从而调节卵母细胞的发育与成熟。LH峰下调卵母细胞cAMP水平是体内促使卵母细胞恢复减数分裂的主要环节。研究表明，LH可以与壁颗粒细胞表达的LH受体结合，通过壁颗粒细胞的旁分泌途径向卵丘细胞和卵母细胞传递信号，最终完成LH信号通路。目前已鉴定发现的24个LH信号通路分子中有10种蛋白质由颗粒细胞表达，包括5种颗粒细胞蛋白(LH受体、腺苷酸环化酶7/9、C型钠尿肽、表皮生长因子、双调蛋白)和5种卵丘细胞蛋白(钠尿肽受体2、eRB1、Cx43、BMPRII、SMAD2/3)[25]。因此，将卵母细胞与颗粒细胞进行共培养可能有助于提高卵母细胞的IVM率。

在将猪的卵母细胞与颗粒细胞进行共培养时，能获得与卵丘-卵母细胞复合物培养相近的IVM率，而且进行ICSI受精后卵裂率与囊胚形成率高于IVF受精组，提示IVM获得的成熟卵母细胞采用ICSI受精方式的妊娠结局更理想[26]。在小鼠卵母细胞IVM过程中，研究人员发现，与将未成熟卵母细胞直接IVM或与卵巢组织共培养相比，与卵丘细胞复合物共培养可显著提高卵母细胞的体外成熟率与囊胚形成率[27]。为了避免颗粒细胞易污染和操作复杂的缺点，白晓红等[28]将颗粒细胞培养液与IVM液按1∶1进行配制，用于体外培养小鼠未成熟卵母细胞，结果表明，颗粒细胞培养液虽然对卵母细胞成熟无显著影响，但有利于成熟卵母细胞受精率和囊胚形成率的提高。在人未成熟卵母细胞的IVM中，惠董娜等[29]发现添加颗粒细胞复合物显著提高GV期和MI期卵母细胞的IVM率，同时有利于MI期来源的成熟卵母细胞的发育潜能，而对GV期来源的成熟卵母细胞发育潜能的改善尚不能确定。

五、卵母细胞IVM前的培养

研究表明，卵母细胞IVM成功率低与各生殖中心用于IVM的未成熟卵母细胞的不均一性有关[30]。大部分生殖中心用于IVM的未成熟卵母细胞是卵泡经过HCG刺激后获得的，而小卵泡(<12 mm)在经过HCG刺激后，卵母细胞的发育阶段不同，包括MⅡ期、MI期、GV期等。为了保证卵母细胞的同质性，研究人员对PCOS患者采用短暂的FSH刺激而不注射HCG的方案进行促排卵，所得卵母细胞能获得约50%的IVM率[31]。另外，体内卵母细胞在卵泡内受到cAMP的调节，使得减数分裂停止在GV期，而体外的卵母细胞由于cAMP水平下降，易自发恢复减数分裂，导致卵母细胞核与质出现不同步成熟[32-33]。为实现IVM卵母细胞的发育同步，研究人员最初考虑利用cAMP磷酸二酯酶抑制剂(PDE3-I)维持卵母细胞体外的减数分裂停滞，从而增强其发育潜能，但去除PDE3-I后并不能成功恢复卵母细胞减数分裂[34]。后来研究人员发现卵丘细胞表达的C型利尿钠肽(CNP)不仅能有效维持未成熟卵母细胞的减数分裂停滞，且去除后容易恢复减数分裂，同时还能有效维持卵母细胞与卵丘细胞间连接[35]。于是有研究人员利用CNP进行牛卵母细胞IVM前培养处理，极大提高了卵母细胞发育潜能与胚胎质量[36]。在小鼠模型中，Romero等[37]也发现，对包裹卵丘细胞的未成熟卵进行成熟前培养(PMC)/IVM时添加CNP显著提高IVM成功率。不仅如此，Zhao等[38]发现，PMC进行24 h可显著提高卵丘细胞的扩展，有利于卵丘扩展与EGF信号通路相关基因的高效表达，以及卵丘-卵母细胞复合物的三磷酸腺苷(ATP)与二磷酸腺苷(ADP)含量增加。同时，与对照IVM相比，PMC/IVM后的卵母细胞受精后其囊胚形成率增加约50%。Sánchez等[39]首先发现，对PCOS女性小卵泡(2～8 mm)来源的卵丘-卵母细胞复合物先利用CNP进行PMC，随后在含有FSH和双调蛋白(AREG)的培养液中体外成熟。该方法获得卵母细胞体外成熟率高达70%，显著高于常规IVM成功率(49%)。此外，研究人员利用CNP进行PMC/IVM对妇科肿瘤患者卵巢来源的卵母细胞进行IVM，也获得了较好的成熟率(56%)，显著高于对照组IVM 的成熟率(35%)，表明此方法在女性生育力保存方面具有较好的应用价值[40]。值得注意的是，以上研究均对卵丘-卵母细胞复合物进行PMC/IVM显示有效，而PMC/IVM对单独卵母细胞的IVM是否有效有待研究。

综上所述，卵母细胞IVM技术策略的改进主要参考卵母细胞体内成熟环境及调控机制的完善程度，目前已可以基本满足ART的要求，但其胚胎移植后的临床结局研究报道相对较少。同时，卵母细胞IVM技术的完善与临床应用尚有几个方面需要注意：IVM技术并不适用于所有未成熟卵母细胞(如遗传因素导致的成熟障碍)；仍需要更多的临床数据加以证实IVM改进方法的可行性；非体内天然存在的抗氧化剂对胚胎发育后续的影响尚不确定，所以其使用需要谨慎；卵母细胞与卵丘-卵母细胞复合物、GV期与MI期的未成熟卵母细胞采取的IVM方式应有所区别。

卵母细胞IVM技术的完善与应用对提高ART成功率意义重大。相信随着卵母细胞成熟调控机制的研究不断深入、临床探索更加全面，卵母细胞IVM技术也将很快在ART中广泛开展。