神经病靶酯酶的表达调控和生物功能

方哲彦，滕茶香，陈加祥

(南昌大学生殖毒理与药理重点实验室，南昌 330006)

神经病靶酯酶(neuropathy target esterase，NTE)作为新型蛋白家族的成员之一，广泛存在于从细菌到人类等多个生物体中，并且在哺乳动物体内的多个组织器官中均有表达。NTE包含一个N-末端调节域和一个C-末端催化域。调节域具有和环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)及其下游分子相似的序列，因此NTE可能受cAMP/PKA/CREB通路的调节[1]。而催化域包含一个patatin结构域，可以水解细胞膜中的重要成分磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)并参与膜相关的细胞活动，维持脂质的稳态。NTE最初被发现是作为有机磷化合物的主要靶位，有机磷毒物可以对NTE产生“老化”作用，造成外周神经和脊髓长轴突的变性引发迟发性神经病(organophosphate induced delayed polyneuropathy，OPIDP)[2]。以往对于NTE的研究更多地关注于它作为一种丝氨酸酯酶的催化功能，而近几年的研究则开始探索cAMP结合位点以及可能调控NTE表达的联系分子[3-4]。当前科研人员正在变性NTE导致轴突衰退以及基因敲除对于中枢神经系统的影响机制中进行深入研究[5]。

1 NTE的发现过程

1968年，JOHNSON[2]在有机磷引发的迟发性神经毒性(OPIDP)的初始发病过程中发现了一种主要靶蛋白NTE，并且指出NTE的存在是OPIDP起病不可或缺的一部分。JOHNSON[2]将鸡脑匀浆同放射性32P标记的丙氟磷(DFP)在恒温下孵育，发现鸡脑中许多蛋白质发生了磷酰化。而预先将神经毒性抑制剂即可诱发OPIDP的神经毒性有机磷化合物同鸡脑匀浆孵育，鸡脑蛋白的放射性32P标记量显著下降，磷酰化明显受抑制，但是非神经毒性的抑制剂却几乎起不到抑制作用。进一步的实验证实磷酰化受到抑制的原因是存在着一种可水解聚对苯二酰对苯二胺(polyphosphoricacid，PPA)的酯酶在发挥作用，这种酯酶被命名为NTE。NTE的发现是OPIDP发病机制研究的一次重大突破，它在有机磷化合物诱发OPIDP的过程中发挥着起始靶点作用。

2 NTE的结构及分子特性

2.1 NTE是新蛋白家族中的一员

NTE是表达于从细菌到人类等各种生物体的新蛋白家族中的一员,它的主要序列与乙酰胆碱酯酶家族中的蛋白质或者任何已知的丝氨酸水解酶相关性较低。这个新蛋白家族中大部分的蛋白质受基因组序列测定为概念上的多肽，全部都包含有几个潜在的跨膜片段[6]。NTE靠近C-末端大约有200个氨基酸的区域是高度保守的，而NTE的丝氨酸活性部位恰恰位于这200个氨基酸区域中。在这个保守区域中，组氨酸、酸性残基连同丝氨酸残基很有可能构成一个催化三元组，参与共同形式的催化反应。此外，PNPLA6基因编码NTE，人和禽PNPLA6基因具有高度同源性(80%)，这表明了生物体在进化过程中保留了主要的该酶功能[7]。

2.2 NTE作为丝氨酸酯酶的反应特性

NTE作为一种丝氨酸酯酶，通过普遍的丝氨酸酯酶机理与羧酸酯底物反应。酶活性位点上特定反应性丝氨酸残基的羟基形成了作用于底物羰基的亲核攻击，这导致了共价酰基酶中间物即酰基酶的形成以及底物乙醇部分的分离。而此后酰基又被水的羟基亲核取代，解放自由酶完成催化循环[6]。而有机磷酸酯类化合物的反应则有所不同。有机磷酸酯类化合物作为底物能够以相似的方式在NTE的催化下释放X基团形成共价酶中间物即磷酸化酶，然而同酰基酶相比，磷酸化酶的水解速度呈数量级显著下降。尽管试剂的亲核性优于水，但是磷酸化酶实际上长期受到抑制。在有机磷酸酯的作用下，磷酸化的酶随后能够经历称为“老化”的二次反应，导致其丢失了一个被束缚的R基团，而剩下的活性丝氨酸部位则共价结合于带负电荷的有机磷酸酯部分，能够显著耐受亲核攻击免受移除，因此自由酶的释放速度缓慢，NTE将长期地以老化磷酸化的形式存在[6]。磷酸化酶的老化速度取决于R基团的性质，一般最慢的是甲基[8]。

3 NTE上游细胞信号转导通路及表达调控

3.1 cAMP/PKA/CREB信号通路对NTE的表达调控

cAMP作为一种第二信使，在真核细胞内扮演着细胞内信号转导的角色，在不同的刺激下控制着生长、增殖、分化和凋亡等细胞生命活动。而NTE氨基末端结构域的序列与蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的调节亚基相似，这暗示了NTE的活性可能受到cAMP/PKA的调控。NTE氨基末端的调节域包含了三种公认的cAMP结合位点，并能够调节下游分子[1]。

CHEN等[3]对细胞给予高浓度的cAMP激动剂以及抑制剂，检测到cAMP水平的变化对于外源性NTE的活性以及表达无影响。然而，海拉细胞中内源性NTE的活性受到cAMP激动剂的影响显著增强，受到cAMP抑制剂的影响则显著减弱。环己酰亚胺能够抑制mRNA翻译从而抑制蛋白质的合成，在应用cAMP激动剂的基础上应用环己酰亚胺后，NTE的活性不再增强，由此证明cAMP上调所导致的NTE活性增高是NTE表达增多引起的。cAMP对于NTE的调节在细胞周期的不同阶段也存在着差异。在细胞周期中，分裂是细胞实现增殖的重要生命活动，在所有分裂的细胞中，细胞膜成分包括卵磷脂(PC)在有丝分裂结束之前需要成倍数的增加从而为分裂的细胞提供原料。而NTE在维持细胞膜脂质的稳态中发挥着重要的作用，其中PC就是NTE催化功能的主要底物，因此NTE水平在分裂期可能受到广泛上调。此外cAMP在酵母细胞周期中发挥着重要的控制作用，它的水平能够随着细胞周期的进展而波动。因此酵母细胞中cAMP对于NTE活性的直接调节作用可能存在于细胞周期的进程中。

cAMP可以调节NTE的表达，而蛋白激酶A(PKA)是cAMP的下游分子，NTE氨基末端调节域的序列又与PKA的调节亚基相似，这些均为NTE水平及活性受到PKA的调节提供了依据。CHEN等[3]又发现NTE蛋白和mRNA水平在PKA抑制剂的影响下显著下降，并且在此基础上应用cAMP激动剂，发现其既不能完全阻断也不能抑制它们的下降，这暗示了受cAMP调控的PKA在控制NTE的表达中是十分必要的。以上这些结果暗示了细胞中NTE水平受cAMP/PKA信号通路而上调。

环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)是一种亮氨酸封闭链式转录因子，可以通过结合目标基因启动子中的CRE序列调节几种基因的表达。除此之外，它还能够被激素、生长因子、细胞因子等生物活性物质所激动，参与调节多种细胞活动，包括细胞增殖，生存和应激反应等。同时CREB又是cAMP/PKA通路的常见靶点，PKA能够在Ser133位点使CREB磷酸化，这种翻译后处理对于它的转录活性起着至关重要的作用。而在近期的研究[4]中，cAMP激动剂毛猴素和PKA抑制剂H89能够以不通过敲除NTE的方式分别促进和抑制海拉细胞中NTE的表达。而在CREB基因敲除的基础上，毛猴素和H89对于NTE的表达均没有干扰，表明了CREB在通过cAMP/PKA/CREB信号通路调节NTE中是必要的。此外CREB基因的敲除能够使NTE基因启动子的荧光素酶活性下降大约50%而不是接近100%，由此证明除CREB之外，其他的转录因子也有可能作用于NTE启动子调控NTE的表达。

另外有研究[9]证实一种能够引发OPIDP的有机磷化合物，在8 h和10 d的实验处理下，能够造成母鸡脑细胞核中PKA和磷酸化CREB水平的下降。这暗示了PKA和磷酸化CREB可能在OPIDP的诱发、演变和发展中扮演着至关重要的角色。

3.2 cAMP/PKA/CREB信号通路以外的NTE调控

cAMP/PKA/CREB已被初步证实在NTE的表达中发挥着重要的调控作用，造成NTE的表达和活性的改变。然而一种产物的表达可能受到多条通路的调控，NTE也不例外。CHEN等[10]应用免疫共沉淀技术发现G蛋白β2亚型可直接联系NTE分子，通过RNA干扰诱发的Gβ2基因的沉默可以导致NTE活性的下调，但是NTE的表达并不受到影响。这暗示了Gβ2蛋白可能在维持NTE活性中发挥着重要的作用，但是其机制还有待更进一步的研究。CHEN等[11]还发现PKC能够下调NTE的活性。通过应用NTE特异性抗体进行蛋白印记分析显示NTE蛋白的水平受到PKC激动剂丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)的作用而下调，并且应用RT-PCR证实这是由NTE mRNA水平的下调引起的，由此证实PKC可以抑制NTE的转录及翻译活动。

NTE可通过泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体这两条途径降解。LONG等[12]发现雄激素受体相关蛋白54(androgen receptor-associated protein 54，ARA54)可以作为泛素连接酶调节NTE的泛素-蛋白酶体降解。ARA54的过表达可下调NTE的蛋白质水平，而ARA54基因的敲除则可抑制NTE的降解，ARA54中的环指(RING)结构域中的突变也可阻断ARA54对NTE的降解。此外D盒(Destruction Box)还被证实是蛋白酶体降解NTE和NTE相关酯酶(NRE，NTE-related esterase)所必需的序列[13]，那么位于D盒的基因突变将极有可能导致NTE的调控失常。

4 NTE功能和调控及功能障碍诱发的疾病

4.1 NTE在细胞生命活动中的功能

有研究[14]表明NTE的生理底物可能是一个连接细胞膜的中间代谢物，具有相当长的羧酸链。而卵磷脂(PC)是真核细胞细胞膜的主要脂质成分，维持PC合成与转化的稳态在细胞分裂以及细胞膜的新生过程中是十分必要的。NTE作为一种磷脂酶则能够催化哺乳动物细胞中磷脂酰胆碱(PC)向甘油磷胆酰(glycerophosphocholine,GPC)的转化。因此细胞中NTE的主要生理底物可能就是PC，NTE的存在可以影响PC的代谢，从而能够维持细胞膜脂质的稳态。此外NTE还可能维持内质网(endoplasmic reticulum，ER)磷脂的稳态，ER磷脂稳态的破坏有助于引发有机磷酸盐诱导的延迟神经毒性。

有研究[14]发现NTE的水平和活性随着细胞周期的进展而被调控，其在G1期上调至最高在G2/M期下调至最低。由于NTE具有维持细胞膜脂质稳态的功能，此调节可能与分裂时细胞膜的变化相关联，因此NTE水平的大幅度波动极有可能影响细胞的正常分裂。实验证实NTE基因敲除可以显著下调NTE基因的表达并且减少甘油磷胆酰(GPC)的水平，但是NTE的抑制并没有影响卵磷脂(PC)的水平，细胞周期的进程也没有受到影响。这暗示了NTE作为一种细胞周期关联蛋白，其数量确实会随着细胞周期的进程而发生变化，但它本身并不能对细胞周期和细胞增殖产生至关重要的影响。

此外，NTE还在神经系统的发育阶段调控神经元和附属神经胶质细胞的相互作用，参与神经胶质细胞之间的信号传导途径，影响神经元发育，最近有关NTE抑制导致斑马鱼运动神经元缺陷的实验就支持了NTE参与维护神经系统完整性的理论[15]。另外有研究[5]显示PNPLA6基因沉默的人类胚胎癌干细胞(NT2)在分化的初始过程中神经元分化数量减少87%，神经突的数量减少55%，神经分叉点的数量减少67%，电活动也发生了变化，每分钟尖峰数与其振幅分别减少了79%和44%。由此证实NTE在神经元分化的早期起着关键作用，但是对分化后期无显著影响。

然而用神经毒性有机磷酸酯丙胺氟(mipafox)作用于NTE只显著改变长非编码RNA的表达，而不影响分化神经元的数量、神经突长度、分支点的数量以及神经胶质和突触标志物的表达，这表明PNPLA6或NTE在神经分化中的作用并不依赖于酯酶中心，因为有机磷酸酯类化合物对NTE的抑制作用已被证实是对酶的催化中心造成“老化”抑制作用[16]。

有研究[17]还发现在成年小鼠的坐骨神经中施万细胞可表达NTE，且在非髓鞘施万细胞中表达最突出，NTE/PNPLA6可参与神经元损伤后发育过程中的非髓鞘施万细胞的发育以及神经元髓鞘再生。神经病靶酯酶在果蝇体内被称为瑞士奶酪蛋白(drosophila swiss cheese,SWS)，是一种进化保守蛋白质，相当于NTE，果蝇胶质细胞SWS基因的敲除的确能够诱导神经元变化和严重的运动缺陷，但由于果蝇不合成髓鞘，因此胶质细胞变化对神经元完整性和功能的影响可能不仅仅局限于髓鞘的形成和再生[18]。

4.2 NTE催化功能的调控

cAMP能够通过依赖于PKA的NTE水平上调导致PC去酰基化向GPC转化。然而，无论是在cAMP激动剂还是抑制剂的作用下，PC水平均没有显著变化而是维持在一个比较稳定的区间，这暗示了细胞中存在除了NTE以外的磷脂酶来维持细胞内PC的稳态。

酵母细胞质磷脂结合蛋白Sec14p能够与卵磷脂形成复合物，这种复合物可以抑制PC合成的中间限速步骤即CDP-choline的产生。实验中敲除了NTE基因的酵母细胞由于NTE催化功能受限导致GPC的产生受到抑制，然而在细胞中并没有发现大量的PC堆积，因为它的产生受到CDP-choline合成限速步骤以及choline吸收减少的干扰[19]，由此证实PC合成的抑制是有可能是通过Sec14p-PC复合物的活动所介导的。最近又有研究[20]显示Sec14p能够联系一种膜磷脂酶Nte1p(Nte1p就是酵母中的NTE)以此增加PC去酰基化向GPC转变的速率。这些证据都表明了NTE水平虽然可以受cAMP水平的调控并显著影响PC向GPC转化的生化过程，但酵母细胞内PC稳态的维持还受到其他生理机制的调控。

4.3 NTE功能障碍诱发的疾病

OPIDP首次引起公众的注意早在1930年，在美国的南部有上千人因中毒性传染病而瘫痪。OPIDP的患者有四肢麻木，皮肤感觉异常的临床表现，并逐渐发展为运动性神经病，重者可出现远端肌肉萎缩。一种有机磷化合物磷酸三邻甲苯酯被认为是引起这种疾病的主要毒物之一。此后的动物模型体内实验均发现诱发OPIDP的有机磷化合物可以有效抑制NTE的活性。然而并不是满足NTE抑制达到临界值这一个条件就能引发OPIDP,事实上OPIDP的发生受到多种因素的影响。有机磷化合物可作为NTE这种丝氨酸酯酶的底物类似物与NTE发生被称之为“老化反应”的共价结合，结合生成的中间物可耐受亲核攻击，水解极度缓慢，引起NTE原本的活性显著下降[21]。

许多学者[22]认为NTE被抑制后发生的老化机制才是诱导OPIDP产生的必要步骤。老化反应是指通过一个快速的两步反应,使得引起迟发性神经病的有机磷酸酯类(organophosphates，OPs)与NTE共价结合,这种变化不仅抑制酶的活性,而且导致R基团的丢失，使得活性部位丝氨酸带负电荷，稳定性增强，自由酶将难以释放。发生老化后的NTE不存在“自我复活”机制，即变性的NTE难以恢复活性。而老化反应是否发生则取决于被抑制的磷酸化酯酶的分子结构[22]。NTE的老化可看作是一种外源生物活性物质对NTE蛋白质进行了转录后修饰,从而抑制NTE的活性，这个过程是不可逆的。OPs修饰的NTE以某种方式造成了“轴突的化学横断面”，引起轴突变性，继而导致OPIDP，其分子生物学具体机制还未阐明。

许多研究[23]证明NTE基因敲除所导致的NTE水平的下调与运动神经性疾病无关，而仅仅表现为神经系统功能的衰退，从而支持了NTE活性减弱在神经衰退疾病中发挥作用的功能下降理论。然而，此结果并不能证明老化假说就是错误的，因为NTE基因敲除和有机磷化合物诱发的毒性作用发病机制有所不同，他们的结果并不相悖。NTE基因敲除仅仅表现为NTE表达下调活性减弱，而有机磷的老化反应致使NTE发生了变性和活性下降。除了OPIDP,最近有研究证实NTE突变还与Boucher-Neuhauser和Gordon-Holmes综合征有关，这些综合征包括性腺机能减退、小脑萎缩、共济失调和认知障碍等[23]。此外，NTE突变可导致Oliver-McFarlane和Laurence-Moon综合征，其特征为视网膜变性伴脉络膜萎缩，而Laurence-Moon综合征还包括进行性脊髓小脑性共济失调和痉挛性截瘫[24-25]。NTE还可以在哺乳动物体内的多个组织器官中有所表达，例如胎盘、骨骼肌、肾、肠、淋巴结、脑等，其中在脑中含量被公认为是最多的[26]，那么NTE的变性和活性下降将对它们产生损害，但其具体机制有可能不相同。比如最近有研究[27]证实NTE水平的降低可以通过Erk1/2和AKT信号通路下调MMP-9(Matrix metalloproteinase-9)而损害滋养细胞浸润，从而促进先兆子痫的进展。

5 展望

NTE作为OPIDP发病初始过程中的主要靶位发挥着至关重要的作用，然而具体的发病机理仍然不明确，“老化”和轴突变性理论没有被广泛认可，因此未来有关变性NTE与轴突衰退的关联仍需进一步研究，同时PNPLA基因敲除或基因沉默所导致的NTE活性下降对于中枢神经系统的影响机制也有待深入研究。近年来关于NTE水平调节的通路及分子是研究的热门，cAMP/PKA/CREB通路已经被证实能够上调NTE，其他通路和调节分子还有待被发现。NTE作为丝氨酸酯酶发挥着重要的催化功能，能作为磷脂酶和溶血磷脂酶发挥功效，维持细胞膜的稳定性。由于NTE具有催化羧酸酯类和有机磷酸酯类化合物等功能，因此它可能对葡萄糖和胰岛素具有潜在的调节作用。鉴于NTE的遗传和化学损伤与轴突变性之间的关联，若NTE能受到胰岛素和葡萄糖调节，那么探讨NTE是否与糖尿病性神经病的发病有关联将具有重要的临床意义[28]。此外，NTE不仅存在于脑内，还分布于其他组织例如胎盘、骨骼肌、肾脏等，因此其他疾病的发生是否与NTE变性有关联还有待进一步探索。