水相法合成磷脂酰丝氨酸体系的优化研究

李令星，吴 寅，李富坚

（翁源广业清怡食品科技有限公司，广东韶关 512000）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）具有提高大脑认知[1]、修复大脑损伤[2-3]等功能，在食品、保健品、医药等多个行业被广泛应用[4-5]。随着对PS功效应用的研究的不断深入，其市场需求也日益增长。在PS众多生产方法中，酶法反应因条件温和、易控、高效简单而成为生产主流。酶法反应将丝氨酸溶于水，磷脂酰胆碱（1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PC）溶于有机溶剂，两相反应。随着人们对食品安全的愈发重视，溶剂残留也愈发受到关注。本文研究了磷脂酰胆碱在纯水相中合成磷脂酰丝氨酸的关键变量，为磷脂酰丝氨酸的工业化生产中提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

正己烷，异丙醇均为色谱纯；乙酸、三乙胺、三氯甲烷均为分析纯；大豆磷脂（哈尔滨九三，PC含量≥55.0%）；丝氨酸（浙江普洛）；磷脂酶D，公司自产发酵制备；PS标准品（Sigma）；PC标准品（Sigma）。

Agilent 1260液相色谱仪配ELSD检测器（安捷伦）；分析天平BSA224S（赛多利斯）；高速离心机（湖北湘仪）；RE52CS旋转蒸发仪（上海亚荣）。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色 谱 柱Lichrospher 100 dio（l100 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相A（正己烷∶异丙醇∶乙酸∶三乙胺=820∶170∶10∶0.8）；流动相B（异丙醇∶水∶乙酸∶三乙胺=850∶140∶10∶0.8），A、B两相梯度洗脱：0～8.5 min，5%→36% B；8.5～12 min，36%→38% B；12～15 min，38%→100% B；15～15.5 min，100%→5% B；15.5～20 min，95% B；流速：1.0 mL/min；进样量：20 µL；检测器漂移管温 度：85 ℃；气体流速：2.5 L/min；柱温：35 ℃[6]。

1.2.2 分析方法

分别精确称取PS、PC标准品10 mg，用三氯甲烷定容至25 mL，混合均匀，制成标准品储备液。用移液管准确吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL和9 mL 储备液，用三氯甲烷定容至10 mL，制成标准溶液，绘制标准曲线。称取10 mg样品，用三氯甲烷定容至25 mL，摇匀，制成样品溶液，并用标准曲线分析样品的PS和PC含量。在选定色谱条件下，以PS、PC峰面积（W）为纵坐标，PS、PC浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为W（PS）= 74.55C+24.68，R=0.999 62；W（PC）=52.61C+ 72.36，R=0.999 29，表明PS和PC在选定浓度下具有良好的线性关系。

1.2.3 单因素实验

称取100 g PC和100 g丝氨酸，加入500 mL水和25 mL酶液，37 ℃反应4 h，反应结束后离心分离丝氨酸，沉淀负压干燥后获得PS产品，测定产品PS和PC含量。通过单因素实验确定纯水相法反应PS的最适条件。

（1）物料比对PC合成PS的影响。按表1称取物料，加入25 mL酶液，37 ℃反应4 h，反应结束，离心、分离丝氨酸，沉淀负压干燥后获得PS产品，测定产品中PS和PC含量，确定最适物料比。

表1 PC合成PS的物料比

（2）酶液添加量对PC合成PS的影响。称取100 g PC和80 g丝氨酸，加入300 mL水，按PC添加量的5%、10%、15%、20%和25%，分别加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL和25 mL酶液，37 ℃反应 4 h，反应结束离心、分离丝氨酸，沉淀负压干燥后获得PS产品，测定产品中PS和PC含量，确定最适酶液添加量。

（3）反应时间对PC合成PS的影响。称取100 g PC和80 g丝氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，37 ℃分别反应2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，反应结束，离心分离丝氨酸，沉淀负压干燥后获得PS产品，测定产品中PS和PC含量，确定最适反应时间。

（4）反应温度对PC合成PS的影响。称取100 g PC和80 g丝氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，分别在28 ℃、37 ℃、42 ℃、45 ℃和50 ℃反应6 h，反应结束，离心分离丝氨酸，沉淀负压干燥后获得PS产品，测定产品中PS和PC含量，确定最适反应温度。

2 结果与分析

2.1 产品图谱

经HPLC检测及图谱分析（图1），产品中PS含量为54.52%（保留时间9.891 min），反应前原料中PC含量为58.35%，反应结束后，PC含量为4.33%（保留时间8.384 min），PC转化率为93.40%。

图1 产品图谱

2.2 物料比对PC合成PS的影响

由 表2可 知，当 水∶PC=1∶1（mL∶g）时，水量不足，物料混合不充分，PS生成率不高；水∶PC=3∶1（mL∶g）时，水量刚好合适，物料混合充分，反应效能达到最高；水∶PC=5∶1（mL∶g）时，水量过多，PC有更多活动空间，PC逐渐凝聚成团，减少了与丝氨酸接触的机会，导致PS合成反而降低，因而水∶PC=3∶1（mL∶g）为宜。当丝氨酸∶PC=0.5∶1（g∶g）时，丝氨酸添加量较少，无法与PC充分接触，反应不充分；丝氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）时，丝氨酸添加量正好合适，与PC充分接触，反应效能达到最高；丝氨酸∶PC=1∶1（g∶g）时，丝氨酸已过量，但PS合成也不会继续加大，且前期丝氨酸用量加大，后期则需要更多纯水洗去多余的丝氨酸，因而丝氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）最适宜。综合考虑。水、PC和丝氨酸的比例为3∶1∶0.8（mL∶g∶g）时最合适。

表2 物料比对PC合成PS的影响

2.3 酶液添加量对PC合成PS的影响

由表3可知，随着酶用量逐渐增大，PS合成率逐渐增加，当酶液添加量为PC的20%时，PS合成效能最大，当酶添加量超过PC的20%后，PS合成反而降低。在酶添加量较少时，活性因子不能充分接触底物，因而PS合成率不高，当酶添加量超出最适添加量后，磷脂酶将本已合成的PS分解成为磷脂酸（PA），导致PS合成率降低。综合考虑，最适酶液添加量为PC的20%。

表3 酶添加量对PC合成PS的影响

2.4 反应时间对PC合成PS的影响

由表4可知，随着反应时间的增加，PS合成率逐渐加大，当反应时间为6 h时，PS合成效能最大，继续反应，磷脂酶开始反作用于PS，使PS分解，导致PS合成率降低。综合考虑，反应时间为6 h最 适宜。

表4 反应时间对PC合成PS的影响

2.5 反应温度对PC合成PS的影响

由表5可知，随着反应温度的升高，PS合成率逐渐增大。当反应温度达到45 ℃时，PS合成效能最大，继续提高反应温度，磷脂酶逐渐失活，失去作用。当反应温度达到50 ℃时，磷脂酶完全失去活性，无法催化PC合成PS，因而选定反应温度为45 ℃。

表5 反应温度对PC合成PS的影响

3 结论

本文通过单因素实验优化了水相法合成磷脂酰丝氨酸在工业生产中的关键变量，结果表明，最适用水量∶大豆磷脂∶L-丝氨酸的比例为3∶1∶0.8（mL∶g∶g）、酶液添加量为PC的20%、反应温度45 ℃、反应时间6 h。在最适反应条件下获得PS含量为54.52%，符合新资源食品质量要求，PC转化率为93.40%。为无溶剂合成PS在工业化生产中提供重要依据。