D-丝氨酸与学习记忆关系的研究进展

王艳

（沈阳医学院公共卫生学院职业卫生与职业医学教研室，辽宁 沈阳 110034）

突触是学习记忆的神经基础，长时程增强（long-term potentiation，LTP）是学习记忆在突触水平上的重要研究模型［1］。在中枢神经系统中，LTP的形成与离子型谷氨酸（gluta⁃mate，Glu）受体N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-Daspartate receptor，NMDAR）的激活密切相关，该受体具有高度的钙渗透性，当被激活后可引起其偶联的钙通道开放，钙离子大量内流，从而激活下游信号转导通路，诱导LTP［2］。NMDAR的激活不仅需Glu，还必需其共激动剂D-丝氨酸的参与，D-丝氨酸与NMDAR的甘氨酸结合位点结合后，Glu才能开放NMDAR偶联的离子通道，发挥其生物学作用［3］。研究显示，降解D-丝氨酸可阻断LTP的产生，而给予D-丝氨酸能够明显改善LTP的诱导与维持［4］。此外，D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）对D-丝氨酸的特异性降解及D-丝氨酸合成酶丝氨酸消旋酶（serine racemase，SR）的基因缺失均可明显改变NMDAR的激活［5-6］。D-丝氨酸被视为突触NMDAR的主要内源性协同激动剂，在大脑突触可塑性调节中起关键作用，与学习记忆紧密相关。本文对D-丝氨酸与学习记忆关系的研究进展进行简要综述。

1 D-丝氨酸在脑中的分布

D-丝氨酸是哺乳动物脑中含量较高的D型氨基酸，Hashimoto等［7］首次报告D-丝氨酸在成年大鼠大脑中大量存在（0.27μmol/g湿重），约占大脑丝氨酸总量的1/4。D-丝氨酸在包括海马体在内的多个大脑区域中大量存在，在认知过程中涉及的大脑突触可塑性机制中发挥重要作用。研究显示，D-丝氨酸在大鼠大脑中的区域分布不均匀，大脑皮层中的浓度较高，小脑和脑干中的浓度较低［8］。Schell等［9］使用对D-丝氨酸具有高度特异性的抗体研究结果显示，D-丝氨酸在大鼠前脑（皮层、纹状体和前嗅球）中浓度较高，在中脑中浓度较低，在小脑中几乎不存在。

在细胞水平，内源性D-丝氨酸与其合成酶SR分布一致，SR起初被认为主要集中在星形胶质细胞（astrocyte，AST）［10］。近期的研究结果显示，在生理状态下，SR主要表达于神经元，AST可合成少量D-丝氨酸，主要合成L-丝氨酸，L-丝氨酸转运至神经元后，在SR作用下转化为D-丝氨酸；而在病理状态下，反应性AST中的SR和D-丝氨酸水平会升高，从而会影响突触间信号传递［11］。早期研究表明，D-丝氨酸由AST合成和释放，由此D-丝氨酸被称为“胶质细胞源性递质”［12］。然而，最近的研究显示，D-丝氨酸主要定位于神经元［13］。Ehmsen等［14］用Srr-/-小鼠作为阴性对照以优化D-丝氨酸的免疫染色，实验观察到超过80%的D-丝氨酸定位于皮质和海马的神经元，与胶质细胞相关的数量较少，D-丝氨酸染色出现在所有皮质层和各区域海马的锥体神经元。除了锥体神经元外，SR和D-丝氨酸还定位于GABA能神经元［15］。

2 D-丝氨酸的合成与氧化代谢

研究显示，SR是催化D-丝氨酸合成的主要酶，SR能够特异催化L-丝氨酸转化为D-丝氨酸，SR水平的改变可影响D-丝氨酸功能［16］。在脑中，L-丝氨酸主要由3-磷酸甘油酸脱氢酶（3-phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）在AST中合成，正常生理状态下，一部分在AST中SR作用下生成少量D-丝氨酸，一部分穿梭至神经元中进一步合成为D-丝氨酸［17］。SR具有双向催化活性，可使D-丝氨酸和L-丝氨酸相互转化，但由于SR对L-丝氨酸具有高度的选择性，因此将L-丝氨酸消旋生成D-丝氨酸是SR主要的催化方向；SR除了具有消旋功能外，还能使L-丝氨酸或D-丝氨酸分解生成氨和丙酮酸盐，SR在体内受到多种因素的调控，5′-磷酸吡哆醛（PLP）是其中最主要的因素，Mg2+和三磷酸腺苷也是SR重要的辅助因子，二者可使D-丝氨酸合成速率提高5～10倍［18］。

DAAO是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基的黄素蛋白酶，人体内DAAO对D-丝氨酸具有高度选择性，是D-丝氨酸代谢的关键酶。在脑中DAAO主要位于AST中［19］，可将D-丝氨酸氧化降解生成羟基丙酮酸和氨，羟基丙酮酸可再由羟基丙酮酸还原酶催化生成D-甘油酸-3-磷酸，最后异生为葡萄糖。

3 D-丝氨酸的转运

突触间隙的D-丝氨酸由转运体进行跨膜转运摄取及清除，D-丝氨酸受2种转运体调控，其一是Na+依赖型丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸-苏氨酸转运体 （alanine-serine-cysteine-threonine transporter，ASCT），主要为ASCT1和ASCT2；另一种为Na+非依赖型丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运体（alanineserine-cysteine transporter 1，Asc-1）。Shao等［20］用原代培养皮质神经元和AST研究D-丝氨酸、Asc-1和ASCT-2转运蛋白的表达，AST和神经元中均可表达ASCT2，Asc-1只表达于神经元，此外，D-丝氨酸的摄取可被ASCT2的特异性底物所阻断，突触间隙D-丝氨酸的摄取可由AST膜上ASCT2所介导。研究表明，ASCT1基因敲除小鼠培养的AST中D-丝氨酸和L-丝氨酸的转运减少了80%～90%［21］。Asc-1是一种位于神经元中的中性氨基酸转运体，被证明主要在神经元的树突和胞体上表达，可以在与其他小的中性氨基酸交换的同时介导D-丝氨酸的双向转运［22］。ASCT1和ASCT2在脑中广泛表达，但对D-丝氨酸的亲和力较低，而Asc-1在脑中表达虽低，却对D-丝氨酸有高度亲和力，在调节大脑D-丝氨酸的水平中起重要作用［23］。

4 D-丝氨酸与学习记忆

研究表明，脑高级神经活动是由相互作用的神经元-胶质细胞网络实现的，AST是神经胶质细胞的主要类型，已知在脑功能中发挥关键支持作用，有助于离子和神经递质稳态，维持血脑屏障，并为神经元提供营养和代谢支持；除此之外，AST还参与促进突触形成及维护突触的正常功能等［24］。突触是神经元间信息传递的关键环节，其可塑性对学习记忆的形成至关重要。电镜观察发现，海马等脑区的突触被AST的突起紧紧包绕，与突触前、后膜形成三联体结构［25］。研究显示，AST可以释放Glu和D-丝氨酸等递质进入突触间隙，D-丝氨酸等递质通过与突触后膜上相应受体结合调控突触可塑性［26］。NMDAR在中枢神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，是学习和记忆过程中的关键受体［27］。NMDAR的开放需要活化Glu和甘氨酸位点，研究显示，D-丝氨酸是激活NMDAR甘氨酸结合位点的内源性共激动剂，只有D-丝氨酸协同Glu开放了NMDAR偶联的离子通道，才能调节突触功能［28］。

D-丝氨酸与突触可塑性有关，在大脑学习记忆形成中起着重要作用。Wong等［29］研究显示了在CA1锥体神经元中SR和D-丝氨酸的树突和突触后定位，此外，利用单神经元SR基因缺失，结果显示了突触后SR在调节NMDAR功能中的作用，单神经元SR基因缺失导致小鼠1个月龄时LTP的消除，外源性增加D-丝氨酸可以恢复LTP。动物实验研究表明，给予D-丝氨酸可改善学习记忆功能，Stouffer等［30］研究显示，腹腔注射给予D-丝氨酸虽未缩短大鼠水迷宫实验的逃避潜伏期，但可延长在平台区停留时间。Bo等［31］对铅暴露大鼠给予D-丝氨酸后发现其缩短了大鼠从Morris水迷宫的逃避潜伏期，增加了大鼠穿过原平台位置的次数，并减轻了海马神经元对铅暴露的病理损伤，恢复了因铅暴露而降低的NR2A的表达水平。Han等［32］研究显示，给予氟乙酸钠可导致实验大鼠水迷宫中的空间学习和记忆严重损害，此外，行为缺陷伴有脑切片海马CA1区LTP诱导受损，外源性D-丝氨酸治疗成功恢复了海马LTP和学习记忆功能。海马中含有高浓度的D-丝氨酸和高密度的NMDAR，由于海马的LTP依赖于NMDAR的激活，而D-丝氨酸是NMDAR的内源性配体，因此D-丝氨酸与LTP的诱导有关。研究显示，SR缺失突变小鼠脑中D-丝氨酸水平明显下降、NMDAR功能降低，同时影响了突触可塑性［33］。小鼠海马锥体神经元SR基因缺失可导致细胞外D-丝氨酸浓度降低［34］，以及CA3-CA1突触的LTP受损［35］。

作为D-丝氨酸合成的前体物质，L-丝氨酸在中枢神经系统中起着关键作用，缺乏L-丝氨酸会导致严重的神经异常［36］。Le Douce等［37］研究显示，小鼠海马AST中L-丝氨酸合成途径失活可降低NMDAR活性，而给予外源性L-丝氨酸可改善小鼠认知功能障碍。PHGDH是L-丝氨酸合成的关键酶，研究表明，PHGDH基因敲除小鼠大脑皮层和海马中的L-丝氨酸和D-丝氨酸水平均显著降低［38］。Yamasaki等［39］证明了L-丝氨酸合成途径中的第一个关键步骤PHGDH仅在大脑的AST中表达。Ehmsen等［14］用L-丝氨酸和D-丝氨酸的免疫细胞化学染色研究了抑制AST中PHGDH表达的影响，结果显示AST中的L-丝氨酸免疫反应性明显降低，神经元中的D-丝氨酸水平明显下降。Neame等［40］研究发现PHGDH抑制剂可使原代培养皮质AST中L-丝氨酸的生成减少75%；在急性皮质切片中，PHGDH抑制剂可将由葡萄糖合成的L-丝氨酸和D-丝氨酸降低70%～80%，表明大量D-丝氨酸源自通过PHGDH途径产生的L-丝氨酸，PHGDH水平的变化通过影响D-丝氨酸的生成而影响学习记忆功能。

研究表明，DAAO活性的增加可降低D-丝氨酸水平，继而引起NMDAR功能低下［41］，用纯化的或重组的DAAO灌注皮质或海马脑片会导致NMDAR介导的LTP的抑制，这可以通过灌注外源性D-丝氨酸来恢复［42］。Mothet等［43］研究显示，用纯化的DAAO灌注培养的神经元和脑切片可以抑制NMDAR激活，而用外源性D-丝氨酸灌流可逆转NMDAR功能的丧失。Nagy等［44］研究结果显示，抑制DAAO可增加大鼠海马神经元的自发放电和NMDA诱发的放电活动，提高认知功能。由于DAAO抑制剂可升高脑内D-丝氨酸水平，从而促进NMDAR的活化，目前一些研究已在临床前研究中联合使用DAAO抑制剂和D-丝氨酸，这可能是增加脑中D-丝氨酸水平更为有效的手段，同时提示DAAO抑制剂在临床上可用于与NMDAR相关的疾病，6-氯苯并［d］异噁唑-3-醇（CBIO）是一种高效的DAAO抑制剂，研究显示，在闭合性头部损伤小鼠模型中，单次CBIO治疗（损伤后24 h）可显著改善认知和运动功能，并减少损伤体积和炎症反应，随着海马体积和海马区神经元数量的增加，提示该化合物具有神经保护作用［45］。此外，苯甲酸钠作为DAAO抑制剂已被证明具有良好的安全性，Howley等［46］研究表明，小鼠口服给药给予苯甲酸钠后，体内DAAO酶占用率和小脑D-丝氨酸水平均明显增加。

Foster等［47］研究显示，D-丝氨酸是中性氨基酸转运蛋白ASCT1和ASCT2的底物，在培养的大鼠海马AST中由2种亚型转运。Kaplan等［21］研究显示，ASCT1基因敲除小鼠出现空间学习记忆能力下降，可能与ASCT1影响了D-丝氨酸水平有关。Asc-1也能够调节D-丝氨酸的释放，Asc-1对于NMDAR的激活和突触可塑性是必需的，抑制Asc-1可减少D-丝氨酸的摄取和释放，并抑制CA1中的LTP［48］。

5 小结与展望

NMDAR在突触信号传递、LTP过程中起着关键作用，D-丝氨酸是激活NMDAR十分重要的内源性激动剂，D-丝氨酸的水平可受SR、DAAO、ASCT及Asc-1水平的影响；此外，D-丝氨酸合成的前体物质L-丝氨酸及其合成酶PHGDH的水平亦会影响D-丝氨酸水平，如果上述任一环节发生改变，均可引起D-丝氨酸水平异常，从而可能影响学习记忆能力，但是上述各环节中何种因素对D-丝氨酸水平起主要作用，以及相应引起的突触信号传递如何改变，需要视研究毒物、研究对象不同而进行分子水平机制的进一步深入研究和探讨。