小麦酯酶在快速测定有机磷和氨基甲酸酯类农药中的应用研究

陆正清 王海平 欧盛生 张迪雅

（江苏食品药品职业技术学院，江苏 淮安 223005）

0 引言

果蔬农药残留检测方法有色谱法、光谱法、和快速检测法。色谱法和光谱法能够既定性又定量地对样品中农药残留进行检测，但所用设备昂贵，检测时间长，经常存在检测结果未出，果蔬可能早已销售甚至已被食用，即便再检测出农药残留超标也无济于事。因此，根据我国果蔬生产和销售的特点，推广一种在田间便可进行快速的、准确的检测方法，对防止农残超标的农产品进入交易市场具有重大意义。

酶抑制率法检测农残具有快速、简单、成本低等优点，因此，此方法已被列入国家标准。标准中所用酶试剂主要为胆碱酯酶，其来源主要为动物及昆虫体内提取，提取步骤烦琐，成本较高。有研究表明，有机磷和氨基甲酸酯类农药也可抑制植物酯酶的活性，因此，也可作为快检酶试剂。本试验采用从价格低廉的小麦中提取小麦酯酶，进行农残快检的检测条件研究，以期得到一种能代替胆碱酯酶的农残快检的酶试剂。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

小麦和青菜均为淮安市场购买。乙酰胆碱脂酶、固兰B盐、无水乙醇、а-乙酸萘酯、硫代乙酰胆碱、氨基甲酸类农药标准品，甲基对硫磷、乐果、敌敌畏等均为分析纯。

1.2 主要仪器

农药残留快检仪（厦门斯坦道科学仪器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 酶抑制率法测农残

胆碱酯酶抑制率法根据GB/T5009.199-2003。小麦脂酶抑制率法测定方法如下：取1.0 ml小麦酯酶提取液于试管中，加入4.0 ml样品测定液、0.1 mL显色剂和4.0 mL pH为6.5的缓冲液，于30℃反应15 min，然后加入底物а-乙酸萘酯0.5 mL，立即放入比色池，记录吸光度变化值。

1.3.2 小麦酯酶的提取

经过加工的小麦粉，加入5倍量的蒸馏水，以9000r/min的转速冷冻离心5 min，取上清液备用。

1.3.3 重复性、通道一致性、稳定性试验

重复性试验：以市售青菜为检测对象，小麦酯酶为酶制剂，连续检测10次，计算相对标准偏差（RSD），检测仪RSD应小于等于1.0%。

通道一致性试验：以质量浓度为1.0 mg/L的甲基对硫磷为标准溶液，连续试验3次，计算每个通道的抑制率，计算各通道平均值及全部通道最大值与最小值的差值。仪器参考值在10%范围内。

稳定性试验：以蒸馏水做对照，检测液为试验对象，20 min内，每隔5 min测量蒸馏水和检测液的吸光度，取每通道变化量的最大值，以蒸馏水吸光度变化值在0.005范围内为宜。

1.3.4 乙酰胆碱酯酶和小麦酯酶对农药的抑制率测定试验

利用乙酰胆碱酯酶和小麦酯酶为酶试剂，在各自最适合酶活条件下，用农残快速检测仪测定2种酶试剂对质量浓度分别为0.2 mg/L乐果、0.2 mg/L敌敌畏、1.0 mg/L的甲基对硫磷、0.02 mg/L灭多威、0.04 mg/L克百威的抑制率。

2 结果与分析

2.1 小麦酯酶最适反应pH的确定

考察pH为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5条件下，小麦脂酶水解а-乙酸萘酯的能力，以最高酶活力为100%计算相对酶活力，pH与酶活力关系如图1所示。

图1 pH对小麦酯酶活性的影响

由图1可知，小麦酯酶反应的最适pH在6.5左右，当pH低于5.5或高于7.5时，酶活力明显降低，因此，使用酶抑制率法测定农残时，若采用小麦脂酶为酶制剂，应配制缓冲液的pH为6.5。

2.2 小麦酯酶最适反应温度的确定

考察反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃条件下，小麦脂酶水解а-乙酸萘酯的能力，以最高酶活力为100%计算相对酶活力，反应温度与酶活力关系如图2所示。

图2 反应温度对小麦酯酶活性的影响

由图2可知，小麦酯酶反应的最适温度在30℃左右，当温度低于20℃或高于40℃时，酶活力明显降低，因此，使用酶抑制率法测定农残时，若采用小麦酯酶为酶制剂，反应温度应设置为30℃。

2.3 重复性、一致性、稳定性试验结果

在最适pH和最适反应温度条件下，以小麦酯酶为酶试剂，采用酶抑制率法测定农残时，测试结果如表1所示。

表1 农残快检仪测试结果

由表1数据显示，农残快检仪测定10次青菜样品的相对标准偏差为0.16%，远低于仪器规定的参考值1.0%，说明以小麦酯酶为酶试剂时，快检仪的重复性好。利用快检仪对甲基对硫磷的各通道测定抑制率，结果显示通道差为4.9%，在仪器要求的10%范围内，说明以小麦酯酶为酶试剂时对各通道的检测结果无影响。20 min内每隔5 min的吸光度变化最大值为0.002，在0.005范围内，说明以小麦酯酶为酶试剂时，快检仪的稳定性较好。

2.4 不同酶试剂对农药的抑制率的影响

由表2可知，以小麦酯酶为快速检测农残的酶试剂时，在小麦酯酶的最适酶活条件时，其对农药残留的抑制效果等同甚至优于乙酰胆碱脂酶对农药的抑制效果，说明小麦酯酶可以作为农残快速测定时乙酰胆碱脂酶的替代物。

表2 乙酰胆碱酯酶和小麦酯酶对农药的抑制率结果

3 结语

采用酶抑制法快速检测农药残留时，以小麦酯酶替代乙酰胆碱酯酶时，小麦酯酶活性最适条件为pH=6.5，温度30℃，最适酶活条件下，小麦酯酶酶抑制率法测定的重复性、通道一致性和稳定性都较好，并且抑制率测定结果与胆碱脂酶法的结果差异不大，说明小麦酯酶可以代替乙酰胆碱脂酶对果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药进行测定。