人参果提取物对缺氧复氧诱导HUVEC细胞损伤的保护作用

李丽静，周凯旋，薛嘉宝，刘 佳，关婉辰，石美玲，王月洁，马晓彤，宋嘉昱，鲍慧玮

（长春中医药大学·吉林长春·130117）

人参果为五加科植物人参 （Panax.ginseng C.A.Mey）的成熟果实[1]，含有人参皂苷、多糖、生物碱、挥发油、氨基酸等，其中主要化学成分是人参皂苷，包括人参皂苷 Re、Rg2、Rb1、Rb2、Rd 等[2-5]。 人参果皂苷在心脑血管疾病、内分泌系统、免疫系统及抗肿瘤方面的作用显著[6-8]。参麦注射液在临床上常用于心血管类疾病的治疗，对心血管系统具有良好的保护作用[9-10]。本研究通过对人参果提取物对缺氧复氧诱导人脐静脉血管内皮HUVEC细胞的研究，以参麦注射液作为阳性对照药，初步探讨其保护血管内皮细胞氧化损伤的作用机制。

1 材料

1.1 仪器

酶标仪 （Bio Tek）；IX73荧光倒置显微镜（Olympus）；二氧化碳细胞培养箱（Thermo Fisher）；超净工作台（Thermo Fisher）。

1.2 药品与试剂

人参果总皂苷（GFS）由课题组提取制备；参麦注射液（购于神威药业）；CCK8试剂（购于同仁化学研究所）；MDC粉末 （购于sigma）；PBS缓冲液 （购于hyclone）；厌氧罐及厌氧袋 （购于三菱 MGC）；SOD、MDA、LDH试剂盒（购于南京建成生物工程研究所）。

1.3 细胞株及培养液

人脐静脉内皮细胞及完全培养液，购自澳赛尔斯生物技术（上海）有限公司。

2 方法

2.1 细胞分组与造模

HUVEC细胞接种于完全培养液培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。HUVEC细胞分成正常组（正常培养）、模型组（缺氧复氧处理）、参麦注射液组（0.4mg/mL参麦注射液+缺氧复氧处理）、人参果总皂苷（GFS）低、中、高剂量组（25.5、50、100μg/mL 人参果总皂苷+缺氧复氧处理）。缺氧复氧造模，除正常组，其余组放入厌氧罐中进行缺氧处理，24h后，打开厌氧罐，进行复氧4h处理。

2.2 人参果总皂苷对缺氧复氧HUVEC细胞的保护作用

对数生长期HUVEC调整细胞密度至5×104/mL，接至96孔板，每孔100μL，继续培养24 h弃培养基，每组设置5个复孔，按给药分组处理细胞后，CCK8法测吸光度（OD值）。

2.3 人参果总皂苷对缺氧复氧HUVEC细胞形态学的影响

对数生长期HUVEC调整细胞密度至2×105/mL，接至24孔板，每孔500μL，继续培养24 h弃培养基，每组设置3个复孔，按给药分组处理细胞后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

2.4 人参果总皂苷对缺氧复氧HUVEC细胞自噬的影响

采用MDC法染色。接种于24孔板内的细胞，给药结束后PBS洗2次，洗去药物，每孔加入MDC染色工作液300μL，于37℃、5%CO2条件下避光孵育20 min，然后各孔加入PBS 400μL清洗2次后，置于荧光倒置显微镜下，观察MDC染色情况。

2.5 人参果总皂苷对缺氧复氧HUVEC细胞SOD、MDA、LDH水平的影响

分组给药同“2.1”项下方法。按试剂盒给定方法检测细胞上清液中LDH的含量与细胞中SOD、MDA的含量。

3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。实验结果以平均数±标准差 (±s)表示，单因素方差分析进行组间均匀比较。

4 实验结果

4.1 人参果总皂苷对HUVEC细胞缺氧复氧模型的保护作用

与正常组相比，模型组的吸光度降低，细胞存活率下降明显（P＜0.01），给予参麦注射液组和人参果总皂苷后吸光度升高，细胞存活率显著增高（P＜0.05），详见表1。

表1 人参果总皂苷对胞缺氧复氧HUVECs存活的影响（±s，n=5）

表1 人参果总皂苷对胞缺氧复氧HUVECs存活的影响（±s，n=5）

注：相比于模型组 *P＜0.05,**P＜0.01

组别 CCK8吸光度正常组 1.12±0.11**模型组 0.57±0.13参麦注射液组 0.72±0.23*GFS低剂量组 0.68±0.25*GFS中剂量组 0.75±0.19*GFS高剂量组 0.82±0.09*

4.2 各组细胞形态学的观察

造模后细胞皱缩、坏死、细胞核消失，视野中有漂浮的死细胞，给予参麦注射液及人参果总皂苷后，细胞形态明显改善，细胞死亡数量减少。详见图1。

图1 各组细胞形态学的观察

4.3 人参果总皂苷对HUVEC细胞缺氧复氧细胞自噬的影响

如图2所示，缺氧复氧造模后MDC染色荧光强度明显增高，给药后各组荧光强度有所下降，说明参麦注射液及人参果总皂苷各剂量组对缺氧复氧损伤的HUVEC细胞自噬具有抑制作用。

图2 人参果总皂苷对HUVEC细胞缺氧复氧细胞自噬的影响

4.4 各组细胞SOD、MDA、LDH水平的检测

与正常对照组比较，模型组细胞中SOD含量减少，MDA含量上升，培养液中LDH含量增高（P＜0.01），各给药组细胞SOD含量增加，MDA含量降低，培养液中LDH 含量降低（P＜0.05 或 P＜0.01），详见表2。

表2 各组细胞SOD、MDA、LDH水平的影响（±s，n=3）

表2 各组细胞SOD、MDA、LDH水平的影响（±s，n=3）

注：相比于模型组，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 SOD（U·mg prot-1） MDA（nmol·mg prot-1） LDH（U·L-1）正常组 41.65±1.24** 1.69±1.21** 197.42±28.78**模型组 18.22±2.69 5.30±2.22 552.79±47.15参麦注射液组 27.92±3.11* 3.34±2.07* 388.54±31.69*GFS 低剂量组 24.29±2.65* 4.98±2.87 510.13±42.13 GFS 中剂量组 26.98±3.13* 4.33±2.75* 476.23±28.67*GFS 高剂量组 29.56±3.28** 3.55±2.26** 419.77±29.73*

5 讨论

血管内皮细胞是组织与血液间的第一道屏障，是最先感受缺氧的细胞之一[11]，缺氧复氧损伤时产生的大量自由基可对内皮细胞形态、功能造成损伤[12]，在心血管疾病中，如动脉粥样硬化，病变中斑块增厚及泡沫细胞耗氧量增加，易导致局部缺氧情况的产生[13]，心肌在供氧供血不足的情况下,易发生心肌梗死和猝死[14]。

人参果为五加科植物人参得干燥成熟果实，文献报道含有多种人参皂苷，对心血管系统具有良好的作用，本实验通过缺氧复氧造成HUVEC细胞损伤，模拟疾病状态下血管内皮细胞的氧化应激环境，来研究人参果总皂苷对血管内皮的保护作用，发现人参果总皂苷对细胞存活具有促进作用，氧化应激在内皮细胞代谢过程中，可以调节自噬，以清除过程中产生的不可逆、氧化的生物分子，维持损伤和去损伤之间的平衡[15]，人参果总皂苷可通过提高细胞对缺氧的耐受能力，从而对自噬具有一定降低作用，SOD、MDA、LDH均与细胞的氧化应激相关[16-17]，实验结果显示，人参果总皂苷对SOD、MDA、LDH的调节能力呈现一定的剂量依赖性。综上所述，人参果总皂苷可能通过提高细胞抗氧化能力，降低自噬水平，对心血管疾病所导致的缺氧损伤发挥保护作用。