柴胡不同煎煮时间五柴胡饮对大鼠解热、免疫作用的影响

王亚杰，周启昕，周 佳，刘玥欣，王晋冀，徐 岩，黄晓巍

（长春中医药大学药学院·吉林长春·130117）

中药柴胡具有解表退热、升举阳气、疏肝解郁的功效。临床广泛应用于感冒发烧，寒战发热、胸痛等。现代药理学研究证明，柴胡具有解热、镇静、镇痛、抗炎、抗菌、增强免疫力、抗抑郁及抗肿瘤等作用[1]。五柴胡饮始载于《景岳全书》：“柴胡1-3钱，当归2-3钱，熟地3钱，白术2钱，白芍半钱，炙甘草1钱，用于中气不足，外邪不散；伤寒，疟疾，痘疮”。《伤寒六书》、《先醒斋广笔记》、《古今医统大全》等古籍中记载：“和解药先煎柴胡”[2-5]。通过前期化学研究，得到结论，柴胡煎煮35 min时，煎煮液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量最高，依据国家中医药管理局2009年颁发的《医疗机构中药煎药室管理规范》中解表类复方汤剂对煎煮时间的相关规定，柴胡煎煮35 min即柴胡先煎15 min[6]，通过观察柴胡不同煎煮时间对五柴胡饮解热、免疫作用影响，探讨柴胡的特殊煎煮时间，并深入探讨五柴胡饮的免疫作用与抑制TLRs/NF-κB信号通路表达的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar大鼠 140 只，雌雄各半，体质量（220±20）g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)-2016-0003。

1.2 药品与试剂

北柴胡饮片、熟地黄饮片、当归饮片、白术饮片：河北祁一堂药业有限公司，批号1702107、1708074、1709066、1704046；白芍饮片、炙甘草饮片：安国市辉发中药饮片加工有限公司，批号160101、160809；布洛芬片，山东方明药业集团股份有限公司，批准文号：国药准字 H37022628， 批号：1807163；IL-4 ELISA kit、IL-10 ELISA kit、TNF-α ELISA kit 和 TLR-4ELISA kit，武汉酶免生物科技有限公司，货号：MM-0191R1、MM-0195R1、MM-0180R1、MM-0221R1；IL-4一抗、IL-10一抗、TNF-α 一抗、TLR-4一抗、GAPDH一抗、HRP二抗，武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66142-1-Ig、60269-1-Ig、17590-1-AP、19811-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP）； 全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光法检测试剂盒、彩虹245广谱蛋白Marker、SDSPAGE凝胶制备试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，货号：BC3711、PC0020、SW2010、PR1920、P1200-2。

1.3 仪器设备

煎药壶 （广东小熊电器有限公司，型号：YSHA15W6）；万分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型号：ME204）；足趾容积测量仪（成都泰盟科技有限公司，型号：PV-200）；电子温度计（深圳美韵声科技有限公司，型号：MS-8805）；高速冷冻离心机（德国 Eppendorf公司，型号：5424R）；酶标仪（美国Thermo公司，型号：Multiskan FC）；电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：DY89-Ⅱ）；电泳仪、电转仪、电泳槽 （伯乐bio-rad，型号：BE6085）；凝胶成像仪（英国 UVItec 公司，型号：Alliance Q9）。

1.4 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠解热作用的影响

1.4.1 动物分组

Wistar大鼠 70 只，体重 180～220 g，雌雄各半，随机分为7组，依次为：空白对照组、模型组、阳性对照组（洛芬布溶液 0.25 g·mL-1）、柴胡先煎 20、30、35、40 min组。

1.4.2 药物制备

五柴胡饮的制备：称取30g柴胡，加500mL水浸泡 30min，分别将柴胡先煎 0、10、15、20min 后加入已用500mL水浸泡30min的 20g当归、30g熟地、20g白术、5g白芍、10g炙甘草继续煎煮20min，过滤药渣后浓缩至含柴胡浓度为1 g·mL-1，放凉，备用。阳性药的制备：布洛芬溶液的制备，取药品粉末40.00 g，用水160 mL制成浓度为0.25 g·mL-1溶液备用。

1.4.3 给药剂量与方法

实验动物进行2天的适应性饲养后，开始给予受试药物。按10 mL·Kg-1剂量对各组大鼠灌胃给药，模型对照组给予等体积的纯净水，连续给药7d。

1.4.4 模型复制和指标检测

在大鼠给药前，测量体温作为基础体温，末次给药1h后，根据各组大鼠体质量10 mL·kg-1分别于皮下注射15%酵母混悬液，致发热模型，分别于致热后1、2.5、3、4、5、6、7、8 h 测量并记录各组大鼠体温。

1.5 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠免疫作用的影响

1.5.1 动物分组

同“1.4.1”。

1.5.2 药物制备

同“1.4.2”。

1.5.3 给药剂量与方法

同“1.4.3”。

1.5.4 模型复制和指标检测

给药前测量各组大鼠足趾体积，作为基础数值，末次给药1 h后，分别于各组大鼠足趾底部皮下注射蛋清液0.1 mL，致各组大鼠足趾急性发炎，分别于致炎后 0.5、1、2、3、4 h 时测量并记录各组大鼠足趾体积，计算足趾肿胀率（足趾肿胀率=(体积-体积基础)/体积基础*100%）。

1.6 脏器指数测定

将“1.5”项下各组大鼠进行腹主动脉取血、处死，取血清、脾脏及胸腺，用滤纸吸干残血后称重。脏器指数=脏器湿重（g）/体重（g）*100%。

1.7 ELISA 检测大鼠血清中 IL-4、IL-10、TNF 和TLR-4的水平

从-80℃超低温冰箱取出血清，按武汉酶免生物科技有限公司提供的ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清中IL-4、IL-10、TNF和TLR-4的含量。

1.8 Westen blot检测大鼠脾脏组织中IL-4、IL-10、TNF和TLR-4表达水平

取“1.5”项下各组大鼠脾脏0.1g，按北京索莱宝提供的全蛋白提取试剂盒说明书提取各组大鼠脾脏组织总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒对样品进行蛋白定量，调节蛋白浓度为2 g·L-1；将蛋白样品与等体积2×样品缓冲液混合后，100℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷却；将样品加入到放置好SDS-PAGE胶的加样孔内，每孔加样20μL，100V恒定电流转膜60 min。转膜结束后，取出PVDF膜，采用TBST洗涤3次，每次5 min，之后将膜放入5%脱脂奶粉中，水平摇床，室温下封闭1 h。封闭结束后，将膜取出，TBST浸洗3次，每次5 min，向洗膜盒中加入相应的一抗（1∶1 000）稀释液，4℃储存，过夜。加 HRP 标记二抗（1:2 000），水平摇床，室温封闭2 h。加入ECL发光液，室温孵育膜1 min。将膜正面朝上放到凝胶成像仪内，照相、记录结果。对电泳条带进行灰度值扫描，对各目的蛋白进行半定量分析。以目的条带与GAPDH灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量[7]。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0统计分析软件进行数据处理，计量资料均采用表示，多组均数组间比较采用t检验分析，P＜0.05表示具有显著性差异。

2 结果

2.1 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠解热作用的影响

各组大鼠皮下注射15%酵母混悬液后，均产生发热现象。与空白对照组比较，模型组在注射15%酵母混悬液后 2.5、3、4、5、6、7、8 h 时，体温明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组、柴胡先煎 15min 组在注射 15%酵母混悬液后 2.5、3、4、5、6、7、8 h 时，体温明显降低（P＜0.05 或 P＜0.01）；柴胡先煎10min、20min组在造模后2.5、3、4 h时，体温明显降低（P＜0.05或 P＜0.01）；柴胡先煎 0min组在造模后2.5、3、4 h 时，体温明显降低（P＜0.05），结果表明，柴胡先煎15 min，解热效果最为显著，持续时间最长，详见表1。

表1 柴胡不同煎煮时间对五柴胡饮解热作用的影响结果（n=10，±s）Table 1 Effect of Different Boiled Time of Bupleurum on Antipyretic Effect of Wuchaihu Drink（n=10，±s）

组别 1h体温（℃） 2.5h体温（℃） 3h体温（℃） 4h体温（℃）空白对照组 36.47±0.15 36.52±0.16 36.56±0.16 36.59±0.17模型组 36.23±0.19 36.82±0.30# 37.87±0.45# 38.73±0.59#阳性对照组 36.11±0.28 36.37±0.24△ 36.75±0.27△ 37.29±0.32△柴胡先煎0min组 36.19±0.27 36.50±0.12△△ 37.44±0.51△△ 38.11±0.52△△柴胡先煎10min组 36.14±0.26 36.44±0.17△ 37.28±0.69△△ 37.87±0.43△柴胡先煎15min组 36.12±0.35 36.41±0.17△ 36.96±0.41△ 37.54±0.36△柴胡先煎20min组 36.15±0.18 36.49±0.14△△ 37.32±0.59△△ 37.92±0.49△

续表1 柴胡不同煎煮时间对五柴胡饮解热作用的影响结果（n=10，±s）Table 1 Effect of Different Boiled Time of Bupleurum on Antipyretic Effect of Wuchaihu Drink （n=10，±s）

续表1 柴胡不同煎煮时间对五柴胡饮解热作用的影响结果（n=10，±s）Table 1 Effect of Different Boiled Time of Bupleurum on Antipyretic Effect of Wuchaihu Drink （n=10，±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

组别 5h体温（℃） 6h体温（℃） 7h体温（℃） 8h体温（℃）空白对照组 36.65±0.17 36.69±0.23 36.64±0.18 36.61±0.14模型组 38.41±0.32# 38.09±0.40# 37.73±0.37# 37.28±0.43#阳性对照组 37.39±0.36△ 37.25±0.40△ 37.17±0.19△ 36.76±0.30△柴胡先煎 0min 组 38.27±0.18 37.85±0.34 37.63±0.32 37.23±0.29柴胡先煎 10min 组 38.02±0.39 37.69±0.27 37.45±0.25 37.01±0.34柴胡先煎15min组 37.70±0.38△ 37.46±0.39△△ 37.29±0.32△△ 36.93±0.35△△柴胡先煎 20min 组 38.07±0.32 37.72±0.33 37.51±0.28 37.06±0.44

2.2 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠免疫作用的影响

蛋清致大鼠足趾肿胀属于异种蛋白的刺激引起的炎性反应，一般持续4～6 h。本研究各组大鼠于足趾部皮下注射蛋清后，均产生足趾肿胀现象。与空白对照组比较，模型组在注射蛋清液后1、2、3、4 h时，足趾肿胀率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组（布洛芬溶液）、柴胡先煎0、10、20 min组在注射蛋清液后 1、2、3、4 h 时，足趾肿胀率明显降低（P＜0.05或P＜0.01），柴胡先煎15 min组时对大鼠足趾肿胀的抑制作用最强（P＜0.01），详见表2。

表2 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠足趾肿胀的影响结果（n=10，±s）Table 2 Effect of different decoction time Bupleurum on Wuchaihu drink on toe swelling of rats（n=10，±s）

表2 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠足趾肿胀的影响结果（n=10，±s）Table 2 Effect of different decoction time Bupleurum on Wuchaihu drink on toe swelling of rats（n=10，±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

组别 1h（%） 2h（%） 3h（%） 4h（%）空白对照组 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 72.36±8.78# 59.18±5.35# 50.97±5.14# 40.77±6.85#阳性对照组 41.63±4.01△ 37.29±4.20△ 31.99±3.64△ 24.68±3.63△柴胡先煎0min组 61.21±4.43△△ 52.32±6.40△△ 48.05±4.53 38.81±2.74柴胡先煎10min组 54.94±6.51△ 48.56±6.54△△ 44.17±4.82△△ 32.76±2.12△△柴胡先煎15min组 44.16±4.02△ 38.82±4.64△ 33.69±2.80△ 27.51±2.34△柴胡先煎20min组 55.34±6.11△ 49.51±7.45△△ 44.74±5.35△△ 32.97±2.34△△

2.3 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠脏器指数的影响

胸腺和脾脏反映人体免疫功能的淋巴器官，当收到炎性介质刺激时，胸腺和脾脏会发生明显的变化，产生相应的免疫反应，以代偿性增大为主要表现。本研究观察了各组动物的脏器指数变化，结果表明，与空白对照组比较，模型组动物脾脏指数明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组、柴胡先煎10 min、15 min组大鼠脾脏指数显著降低 （P＜0.05或 P＜0.01），说明柴胡先煎15 min时对大鼠的胸腺、脾脏肿大治疗效果最显著，详见表3。

表3 各组动物脾脏指数的比较（n=10，±s）Table 3 Comparison of animal spleen index in each group（n=10，±s）

表3 各组动物脾脏指数的比较（n=10，±s）Table 3 Comparison of animal spleen index in each group（n=10，±s）

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

组别 胸腺指数 脾脏指数空白对照组 0.10±0.013 0.28±0.031模型组 0.18±0.025# 0.48±0.094#阳性对照组 0.12±0.017△ 0.33±0.045△柴胡先煎0min组 0.15±0.022△△ 0.43±0.055柴胡先煎10min组 0.15±0.024△△ 0.42±0.053△△柴胡先煎15min组 0.12±0.020△ 0.37±0.044△△柴胡先煎20min组 0.15±0.023△△ 0.42±0.062

2.4 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠血清中IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平的影响

ELISA法检测表明，与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组、柴胡先煎10、15、20 min 组大鼠血清 IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平明显降低（P＜0.01），柴胡先煎15 min大鼠的免疫作用最强，详见表4。

2.5 不同煎煮时间柴胡对五柴胡饮对大鼠脾脏中免疫因子IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4水平的影响

Western Blot检测结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠脾脏中IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4表达水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，阳性对照组大鼠脾脏组织中IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4含量均有明显降低（P＜0.01）；柴胡先煎 10 min、15min 时大鼠脾脏组织中IL-4、IL-10水平明显降低 （P＜0.01），柴胡先煎 0、10、15、20 min 大鼠脾脏组织中TNF-α和TLR-4含量均有明显降低 （P＜0.05或P＜0.01），详见表5，图1。

表4 各组大鼠血清中 IL-4、IL-10、TNF 和 TLR-4 水平（n=10，±s）Table 4 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in of rats in each group

表4 各组大鼠血清中 IL-4、IL-10、TNF 和 TLR-4 水平（n=10，±s）Table 4 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in of rats in each group

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

组别 IL-4（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L） TLR-4（ng/mL）空白对照组 186.08±14.73 78.64±5.30 101.13±4.26 1.26±0.14模型组 243.34±18.81# 101.92±4.68# 129.56±5.90# 30.23±3.24#阳性对照组 199.20±13.82△ 82.63±4.24△ 105.87±7.30△ 12.81±1.83△柴胡先煎 0min 组 226.14±22.62 97.31±4.69 125.77±6.74 24.19±2.08 △柴胡先煎10min组 214.57±18.61△ 92.63±4.03△ 114.28±5.75△ 21.33±2.62△柴胡先煎15min组 207.53±17.21△ 87.69±3.89△ 111.15±4.39△ 16.01±1.75△柴胡先煎20min组 218.97±11.97△ 94.93±2.64△ 119.33±4.68△ 22.53±2.45△

表5 各组大鼠脾脏中 IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平（n=3,±s）Table 5 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in spleen of rats in each group

表5 各组大鼠脾脏中 IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平（n=3,±s）Table 5 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in spleen of rats in each group

注：与空白对照组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

组别 IL-4 IL-10 TNF-α TLR-4空白对照组 0.50±0.054 0.21±0.015 0.68±0.022 0.041±0.0052模型组 0.72±0.047# 0.47±0.040# 1.11±0.15# 0.54±0.039#阳性对照组 0.044±0.0084△ 0.32±0.022△ 0.07±0.003△ 0.30±0.027△柴胡先煎0min组 0.79±0.060 0.52±0.015 0.65±0.042△ 0.50±0.028△△柴胡先煎10min组 0.30±0.030△ 0.41±0.035△ 0.41±0.055△ 0.35±0.033△柴胡先煎15min组 0.21±0.030△ 0.38±0.039△ 0.32±0.026△ 0.33±0.034△柴胡先煎20min组 0.55±0.033△ 0.43±0.031△△ 0.66±0.074△ 0.39±0.056△

图1 各组大鼠脾脏组织中IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4表达电泳图Figure 1 Electrophoresis of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 expression in spleen of rats in each group

3 讨论

柴胡是传统医学中解表药的代表药物，具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气等功效[6]。前期研究结果表明，柴胡在煎煮35 min时有效成分溶出率最高，而解表类中药的煎煮时间一般规定为20 min，故柴胡应以先煎15 min为宜。本次研究依据前期研究结果，制定实验内容，致痛动物模型主要包括热刺激和化学刺激两种。本研究采用热板法复制大鼠疼痛模型，具有造模时间短，结果明显，可多次检测等优点[8-10]。结果表明，与空白对照组相比，感冒疏风片组、阳性对照组、柴胡先煎15min组大鼠的痛阈时间存在显著性差异，柴胡先煎15min的五柴胡饮溶液可将大鼠的痛阈时间自22 s延长至37 s，镇痛效果显著。

复制非特异性炎症动物模型主要依据炎症的发生、发展过程，采用冰醋酸、组胺、二甲苯等化学物质进行模型复制[11]。本研究采用蛋清进行大鼠足肿胀的动物模型复制，操作难度低，使用排水法进行数据监测可反复多次测量，减小误差[12]。本研究结果表明，MG造模1h后产生明显的足趾部肿胀，与空白组差异明显，模型可持续4～6h，各给药组动物足趾肿胀率均有不同程度下降，柴胡先煎15min组差异最显著。脾脏和胸腺是人体免疫系统的重要器官，脏器系数常被用来评价机体免疫功能。本研究实验结果表明，免疫缺陷模型大鼠脾脏和胸腺系数明显升高，代表机体发生炎症反应时，免疫器官会发生代偿性增大或水肿。五柴胡饮可明显降低模型大鼠的脾脏和胸腺系数，提高机体的免疫功能。结果表明，柴胡先煎15 min时的五柴胡饮煎煮液对大鼠的胸腺、脾脏肿大治疗效果最显著。

TLRS/NF-κB信号通路的相关表达与机体的免疫调节息息相关，TLRS/NF-κB信号通路上的蛋白因子不仅参与机体炎症反应，调节细胞内外的正、负反馈调节，还参与淋巴细胞的合成，调节细胞因子与生长因子[13]。白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）、TNF-α、TOLL样受体-4（TLR-4）均是该通路上重要的信号分子，这些信号因子的蛋白表达对机体免疫反应存在一定影响。IL-4是T细胞产生的一种细胞因子，通过与B细胞相应受体结合，活化抗原表达，促进B细胞增殖[14]。IL-4大量产生后对其生成的前体物质具有一定的决定作用，外源性IL-4可以诱导Th2细胞分化为Th2效应细胞，继而大量分泌IL-4、IL-13等细胞因子，引起机体发生变态反应、哮喘等[15]。研究表明，IL-4可以抑制 IκB激酶 （IKK）、髓样分化因子（MyD88）的活性，进而抑制TLRS/NF-κB信号通路的活化活化[16]。IL-10是一种由CD4+T、CD8+T细胞、B细胞、Thl、Th2细胞等细胞产生，具有抑制炎性介质释放，产生免疫抑制的作用[17]。IL-10抑制单核巨噬细胞的生成，降低其抗原呈递作用，通过抑制NF-κB对DNA的结合活性及抑制IκB激酶的活性来抑制NF-κB的激活[18]。TNF-α是一种由活化的巨噬细胞产生，参与细胞的损伤、拮抗病毒活性、促进成纤维细胞增殖、诱导细胞凋亡、激活核转录因子生物活性的蛋白质，通过促进 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 等免疫因子的产生，参与全身免疫反应[19]。TNF-α刺激内皮细胞和巨噬细胞分泌IL-1和GM-CSF等炎性因子，导致炎症的发生和发展，通过激活一氧化氮合酶(iNOS)，促进NO合成，进而刺激单核细胞释放IL-8，使炎症反应加重[20]。TLR-4是一种广泛分布于免疫细胞、心肌细胞和呼吸道上皮细胞以及绝大多数恶性肿瘤细胞的跨膜蛋白，具有促进T细胞和肝滤泡辅助性细胞的繁殖和分化，促进炎症因子干细胞转录因子、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）合成和分泌的功能[21]。研究表明TLR-4通过活化NF-κB信号通路，介导IL-1、IL-6、TNF-α炎性因子大量释放，而加重组织损伤，通过来上调炎性因子COX-2和提高前列腺素E2、金属蛋白酶的表达[22]。研究结果表明，柴胡先煎15min的五柴胡饮溶液，可以显著降低模型大鼠的血清、脾脏TNF-α水平，抑制模型大鼠的炎症反应。TLR-4是TLRS家族表达最广泛的免疫因子，其表达水平的提高可以激活TLRS/NF-κB信号通路，减弱机体免疫系统对炎性细胞的监视和杀灭作用。研究结果表明，柴胡先煎15min的五柴胡饮溶液，可以显著降低模型大鼠的血清、脾脏TLR-4水平，抑制模型大鼠的炎症反应。