ATP 依赖型钾通道对心肌缺血再灌注损伤介导的细胞凋亡及相关蛋白的影响

聂晓丽，蔺雪峰，李阳

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头)

0 引言

缺血性心脏病是死亡率极高的疾病[1]，缺血再灌注损伤(MIRI)是引起缺血性心脏病的重要机制，在这个过程中可引起心肌超微结构不可逆性损伤，造成心肌代谢、功能及电生理等诸多方面的影响。在急性冠脉综合征治疗中，可通过各种治疗办法降低死亡率，但MIRI 仍无法避免，可加重缺血心肌结构的损伤及功能代谢障碍，是导致缺血心肌无法达到理想治疗效果的主要难题[2]。大量基础实验与临床研究结果显示，钾离子通道可能在调节新陈代谢方面发挥了新的作用[3]，并且可以抑制Ca2+超载[4]，为临床防治MIRI 提供新的理论依据，并将推动该领域产生巨大的进展。

1 实验方法

通过细胞培养、建立缺氧/复氧细胞模型、在高倍显微镜下观察细胞形态、MTT 法检测细胞凋亡、Western Blot 检测caspase-3、bax、bcl-2 表达。

2 结果

(1)MTT 法检测细胞凋亡结果显示：在经过缺氧处理后的H9C2 心肌细胞相对增殖率发生显著变化，并且随着复氧时间的不断延长，其相对增值率也在逐渐下降。在缺氧4h 复氧3h 后下降至50%～60%(P＜0.05)，因此可将缺氧4h 复氧3h 作为后继实验的观测点；在钾离子通道抑制剂处理后，缺氧4h复氧3h 时H9C2 细胞的相对增殖率显著降低(P＜0.05)。

表1 MTT 法检测钾离子通道抑制剂对H9C2 细胞相对增殖率的影响

(2)Western Blot 检测 caspase-3、bax、bcl-2 的表达

3 讨论

心肌细胞凋亡参与了许多心脏疾病如心力衰竭、心肌梗死、心肌病、心律失常等疾病的发生发展过程，并且细胞凋亡在MIRI 进展中也发挥着重要作用[5-6]。当供应心脏的血管发生闭塞后会使流向心脏的供血和氧气减少，进一步导致心肌缺血，在60 s 内心肌的收缩力将逐渐开始丧失，其他变化则需更长的时间，可能会发生再灌注(血流恢复)，但在完全阻塞血流后20-40 分钟内会发生活力的丧失(不可逆性损伤)。心肌收缩力的丧失和致命性心律失常的出现是造成大多数猝死事件的主要原因，缺血最终导致心肌细胞坏死并形成梗塞。

本研究发现钾离子通道抑制剂降低了Bcl-2 水平，加强Bax 与线粒体联系，增加了心肌细胞的凋亡，对MIRI 发挥促进损伤作。但钾离子通道如何在细胞凋亡调控中发挥作用还不完全清楚。目前KATP 通道的作用备受关注，可能在调节新陈代谢方面发挥了新的作用[7]。在各种类型的KATP 通道中，就其核苷酸敏感性，其生物物理性质以及对药理的敏感性而言，在不同的组织和细胞类型上彼此之间存在显著差异。使用新鲜分离的成年大鼠心肌细胞建立与体内IR 条件相似的A/R 模型，结果发现mitoKATP 开放或关闭可引发能量代谢相关基因(MT-ND6，Idh2 和Acadl)的改变，说明KATP 通道可干扰能量细胞的能量代谢，在MIRI 期间为心肌细胞保持能量产生与消耗的平衡。mitoKATP 是线粒体内膜上的钾离子通道，在正常情况下处于关闭的状态，细胞内ATP 浓度升高时可将其显著抑制，但该通道在细胞缺血缺氧即ATP 浓度降低时可被激活，从而降低了ROS 的产生。由此可以看来，mitoKATP 的深入研究可以为减轻MIRI 提供新的理论依据。心血管系统中存在多种KATP 通道亚型，每种亚型在心脏的各个区域有其专门的传导系统。在大多数研究中，KATP通道开放剂在心脏缺血期间具有心脏保护作用。KATP 通道是许多细胞和组织功能不可或缺的部分，该通道的开放与抗心肌缺血再灌注损伤及细胞凋亡密切相关。因此，KATP 通道在心血管系统中发挥着重要的生理作用。证明了AMPK-Kir6.2/KATP 信号通路介导了白藜芦醇对心脏的保护作用，而含Kir6.2 的K-ATP 通道在白藜芦醇保护心脏的过程中发挥了重要的作用，不但可明显降低血清LDH 和CK 活性和心肌梗死的面积，而且可抑制缺氧/复氧引发的细胞凋亡。最近的研究结果表明丹参多酚酸盐可以显著提高H/R 损伤后H9C2 大鼠心肌细胞的活性，减少H/R 损伤带来的危害，而应用mitoKATP 特异性的阻滞剂5-HD 可拮抗上述的心脏保护作用。研究显示丹参多酚酸盐可下调P53、Bax 的mRNA 表达水平，上调Bcl-2 的mRNA 表达水平，同时也可增加PI3K、Akt 的mRNA 表达水平，表明丹参多酚酸盐可能依赖于PI3K/Akt 及mitoKATP 的通路来调节细胞凋亡的相关基因表达，从而减轻心肌缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞的程序性死亡，为临床工作中保护心肌缺血再灌注损伤打下了坚实的理论基础。

图1 bax/β-actin

图2 bcl-2/β-actin

图3 cas pase-3

图4 bcl-2/bax

线粒体KATP 通道的主要功能可能允许K +转运到线粒体基质中，这与K + / H +反向转运蛋白的操作协同作用，可能参与线粒体体积体内平衡。研究发现，通过影响mitoKca和mtioKATP 介导线粒体功能与心肌动作电位形成机制，mitoKca 通道开放可缓解再灌注心律失常症状，抑制动作电位发生，延迟心肌缺血再灌注心律失常的出现，缩短缺血再灌注心律失常的持续时间。

综上所述，ATP 依赖型钾通道在心肌缺血再灌注损伤介导的细胞凋亡过程中发挥着至关重要的作用，探讨其具体病理生理机制并研究ATP 依赖型钾通道在缺血再灌注所致心律失常监测、心衰、治疗及预后的评估提供了新的治疗干预靶点，为在临床工作中治疗心肌缺血再灌注损伤开拓临床思维提供了更多新的选择。