甲型流感病毒M2蛋白研究进展

刘亚辉　郭潮潭

[摘要] M2蛋白是流感病毒包膜上的具有离子通道活性的膜蛋白，在流感病毒的整个生活周期中具有重要作用。M2蛋白N端高度保守，是研究通用疫苗的重要靶点，其跨膜区在病毒核糖核蛋白（RNP）复合体入核过程中起重要作用，同时又是药物作用的靶点，但耐药性突变体的出现使得新药的研究变得更加紧迫，M2蛋白还参与病毒的出芽过程，对病毒颗粒的形成非常重要，M2蛋白还能通过复杂的机制操纵细胞自噬和凋亡，从而控制病毒的复制。本文就M2蛋白在疫苗研究、质子传导、药物研究、装配与出芽、自噬与凋亡等几个方面的最新研究进展作一综述。

[关键词] 流感病毒；M2蛋白；离子通道；出芽

[中图分类号] R511.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（a）-0037-04

[Abstract] M2 protein is a kind of membrane protein with ion channel activity in the envelop of influenza virus， which plays an important role in the life cycle of influenza virus. The N-terminal of the M2 protein is highly conserved， which is an important target for researching the universal vaccine. The transmembrane domain of M2 protein plays an important role in the progress of virus ribonucleoprotein complex entering into the nucleus， it is also the target for drug binding， but the appearance of drug-resistant mutants make the research of new drugs much more urgent. M2 protein also participates in the progress of virus budding， which is of great importance for the formation of virions. M2 protein can control the autophagy and apoptosis for the purpose of controlling the replication of virus through sophisticated mechanisms. This paper makes a review of M2 protein in the following aspects： vaccine research， proton conduction， drug research， assembly and budding， autophagy and apoptosis.

[Key words] Influenza virus； M2 protein； Ion channel； Budding

流感病毒屬于正黏病毒科，是一种内含8条节段状RNA的负义RNA病毒，能够感染禽类、人类和其他多种哺乳动物。流感病毒RNA编码多种蛋白，其中病毒包膜上有HA、NA和M2三种膜蛋白，M2蛋白在流感病毒感染宿主细胞中具有重要作用。M2蛋白由流感病毒RNA第7片段经剪接编码表达，是流感病毒包膜上的一种跨膜蛋白，其通过二硫键将相邻的二聚体连接而形成左手螺旋的四聚体。M2蛋白由97个氨基酸组成，包括24个氨基酸残基形成的N末端胞外域（extracellular domain of M2，M2e），19个氨基酸残基形成的跨膜域，54个氨基酸残基形成的C末端胞质尾，胞质尾的前17个氨基酸残基形成了一个两性螺旋[1]。近年来针对M2蛋白的研究取得了长足的进展，促进了流感病毒的防治，本文针对这些研究进展作如下综述：

1 M2蛋白与疫苗研究

M2非常保守，而M2e高度保守。自1933年以来从人体分离的流感病毒，M2e序列几乎没有发生改变，与禽流感病毒的M2e序列也仅仅有几个氨基酸不同[2]，这为“通用疫苗”的研究提供了结构基础。但单独的M2e免疫原性很弱，在小鼠中并不能够诱导足够的免疫反应，与铝或弗林佐剂结合可增加其免疫原性[3]。因此，增加M2e的免疫原性，成为当前“通用疫苗”研究的主要方向。有人将异源的M2e构成重复序列M2e5x，用酵母表达系统表达，然后用佐剂AS04联合M2e5x免疫小鼠，诱导的抗体能够与异源M2蛋白反应，产生广泛的交叉免疫[4]。将人与禽M2e与鼠伤寒沙门菌的鞭毛蛋白融合，用本氏烟草植物表达后获得了占总蛋白30%的融合蛋白，构建的融合蛋白免疫小鼠后诱导了特异性的免疫，高效地保护了小鼠[2]。将M2e与乙肝核心抗原结合形成的类病毒颗粒进行动物实验也提供了很高的保护率[5]。这些结果均说明了M2e与佐剂及免疫原结合增加了M2e的免疫原性，除此之外，不同的免疫途径也会对疫苗的效果产生影响，鼻腔免疫的效果优于皮下注射[6]，而与其他的疫苗联合使用，也能够明显增强免疫效果[7]。因此，从增强M2e免疫效果这点来看，合适的佐剂，增加M2e序列数量及其多样性，构成融合蛋白及类病毒颗粒，合适的免疫途径，疫苗的联合使用等都是可行的方法。

以M2e为基础的疫苗并不是通过抗体的中和作用来发挥其交叉保护作用的，Lee等[8]提出保护机制是抗体依赖的细胞毒性作用和补体依赖的细胞毒性作用。但在2011年，研究者却发现了一种具有中和活性的M2抗体M2-7A[9]。endprint

2 M2蛋白与质子传导

M2跨膜区形成一个倾斜的四聚体螺旋，该区域具有离子通道活性，起到了传导质子的作用，M2蛋白的质子传导作用能使病毒内部酸化，促进病毒RNP入核进行病毒的复制和转录[10]。M2跨膜区是一个充满水的孔道，跨膜区的Val27、Ala30、Ser31和Gly34在孔中成线性排列，Gly34、His37、Trp41和Asp44之间形成了三层水分子簇，对于质子的连续传导非常重要[11]；质子传导机制的核心是M2蛋白His37咪唑环的一半和M2蛋白螺旋束内部水之间的质子交换，Val27和Trp41在孔的两端形成了两个门[12]，Asp44可能将Trp41门稳定为关闭构像而起到稳定四聚体的作用，直到一定数量的质子在His37四聚体上积累[11]。

His37-Trp41四聚体是酸化和质子传导的中心，其中的His37起到了质子传导的作用，通道内的4个His37残基形成了一对咪唑-咪唑二聚体，通道N端的水合氢离子将一个质子传递到咪唑-咪唑二聚体，当第3个质子结合到咪唑-咪唑二聚体上后，2个咪唑环旋转（大约55°）分开，之后Trp41门打开，质子释放，进入病毒内部，释放质子的咪唑-咪唑二聚体随后重组，为下一个循环的质子传导做准备[13]。在整个质子传导的过程中，通道的构像并不是不变的，而是随着His37质子化程度的改变而改变，通过在高pH和低pH环境下比较跨膜区域的结构发现，其pH依赖性的构像改变可能通过交替地改变通道N端和C端开口的大小而促进了质子传导[14]。Acharya等[12]提出通道在不同的pH下存在三种不同的构像：不带电形式（pH 7.5～8），中间形式（pH 6.5）以及低pH形式（pH 5）。在不带电形式下，Val27门是打开的，质子能够从外部通过Val27门扩散进孔隙，使His37质子化，相对而言，Trp41门疏水性开口很小，His37残基并未暴露给病毒内部环境，不能释放质子，随着His37质子化程度的增加，通道N端倾斜角度开始增加（相对于孔隙轴）：从不带电形式的16°增加到中间形式的31°，最后增加到低pH下的38°。这种运动逐步地压缩Val27门，最后使其在低pH下关闭了，相反，Trp41门极性开口逐渐变大，开始将质子化的His37暴露给病毒内部，当达到最高电荷状态时，Trp41门打开了3～4 ？魡，使得质子释放进病毒内部。当一个或几个质子从His37分离后，M2的整体构像将会恢复成类似于中间形式的构像。

3 M2蛋白与药物研究

目前有两种药物能够抑制M2离子通道活性：金刚胺和金刚乙胺。越来越多的证据表明，药物结合在通道内部孔的N端，药理学结合位点为Ser31[15-16]。但Schnell等[17]发现金刚乙胺可以结合到通道C末端面向脂质的外表面，随后的研究也证实了这一现象，金刚乙胺结合在Asp44周围，与Asp44形成一个氢键[18]。药物对通道孔内和通道外表面这两个结合位点的亲和性并不一样，通道孔内的药物结合位点为高亲和性位点，外表面的药物结合位点为低亲和性位点[18]。

目前认为药物抑制的机制有两种：对于通道孔内部（Ser31周围）的结合位点，药物主要直接阻塞了质子转运；而对于外表面（Asp44周围）的结合位点，药物则通过变构抑制效应抑制质子传导[16，18]。高pH下，Val27门是打开状态，金刚胺进入孔，在Val27门处形成空间障碍，阻止His37的质子化而严重限制质子转运进入病毒内部[19]；而在低pH（5.5）下，金刚胺的结合诱导了四聚体的稳定化和通道C末端Trp41门的关闭，因而使得M2通道失活[20]。亚基内氢键和盐桥连接了Trp41、Asp44和Arg45的侧链，稳定了Trp41门，药物与Asp44结合，通过将Trp41门稳定为其关闭构像，而抑制通道的变构效应，使得通道无法打开[16]。由此可见，无论是阻塞机制还是变构抑制机制，最终都阻止了质子的内流，使得通道构像不再发生变化，处于一个稳定状态。

随着药物的应用，出现了以V27A、L26F和S31N为主的抗药性突变，S31N的突变占了其中的绝大部分[21]。在S31N突变M2中，金刚胺进入通道的深处，水分子环绕在药物周围，能够轻松地传导质子，因此药物结合并没有抑制质子的转运[22]。近年来有关针对抗性突变体的研究取得了不错的进展，研究者人员发现了一些抑制剂能抑制抗药性S31N突变体[23]，而抑制L26F和V27A抗药性突变体的抑制剂也已经被合成出来[24]。

4 M2蛋白与病毒装配及出芽

流感病毒完成其转录复制后，开始病毒的出芽，出芽位点位于感染细胞顶端质膜的脂筏区域。流感病毒的出芽始于HA和NA在脂筏区域的聚集，聚集可能导致了膜的变形以及病毒出芽的开始，随后M1结合到HA和NA的胞质尾，招募病毒RNPs[10]，M2并不和脂筏相联系，而是和HA在质膜区域相聚集，M1在其中起到了桥梁的作用[25]，M2和M1的相互作用位点为氨基酸残基70～77[10]。M2被招募到胆固醇丰富的脂筏区域，M2在此胆固醇丰富的区域不能诱导正膜弯曲，可能诱导负膜弯曲，负膜弯曲可能稳定了HA和M1在出芽起始阶段诱导的正膜弯曲，这种稳定作用可能促进了丝状病毒的形成，延长了病毒出芽过程，使得剩下的病毒蛋白和病毒基因组能够被招募到脂筏区域[1]。

M2蛋白的积累，使得M2蛋白位于出芽病毒的颈部，此区域位于出芽病毒的脂质有序相和块状质膜的无序相之间的边界，该区域胆固醇相对较少，M2蛋白介导了从质膜的低胆固醇区域在体内的出芽，这是一种依赖于M2蛋白胞质尾近膜区两性螺旋的方式，在此低胆固醇区域，两性螺旋插入膜，改变了脂质无序相和脂质有序相之间的线性张力，这为膜弯曲提供了动力，质膜随即发生正膜弯曲，导致了质膜的分离[1]。在出芽的最后，出芽病毒的HA依然與感染细胞上的唾液酸糖链相连，病毒包膜上的NA水解唾液酸与糖链之间的糖苷键，最终导致了子代病毒的释放[10]。endprint

5 M2蛋白与自噬及凋亡

自噬是一种能使细胞在不同压力条件下存活的机制，涉及溶酶体降解的胞质蛋白和细胞器的再循环利用，自噬能够为维持和修复宿主细胞的重要功能提供营养[26]。Gannagé等[27]发现M2蛋白能够抑制自噬体的降解，通过N端60个氨基酸抑制自噬体和溶酶体的融合，导致了不成熟自噬体的蓄积，对比巨自噬缺陷和有巨自噬能力的细胞发现，巨自噬缺陷的细胞病毒蛋白和病毒RNA释放增加，而有巨自噬能力的细胞情况相反，RNA可引起炎性细胞因子的释放，因此，M2阻止了自噬体和溶酶体的融合，导致了不成熟自噬体的积累，而这些自噬体可以保留大部分的病毒RNA和病毒蛋白，限制了它们的释放，减轻了由病毒RNA释放引起的炎性反应和病毒蛋白释放引起的免疫反应，从而有利于病毒复制。M2除了干扰自噬体和溶酶体的融合来干扰自噬外，还可以通过M2胞质尾的LIR模体来操控自噬机制，LIR模体在M2胞质尾高度保守，能和自噬蛋白LC3直接相互作用，将LC3定位至质膜，自噬体靠近LC3所在的质膜，可能为病毒出芽提供合适的能源，进一步研究发现M2胞质尾的F91xxI94模体与LIR模体高度吻合[28]。

M2蛋白不仅与自噬有关，与凋亡也有联系。流感病毒的复制在感染细胞中引起了两阶段的反应：在早中期阶段的抗凋亡反应和晚期阶段的诱导凋亡反应[26]。在感染后的早期及中期，为了使宿主细胞存活，促进病毒的复制，病毒蛋白NS1通过与PI3K-AKT复合物相互作用下调了凋亡；而在感染的晚期，M2蛋白则是通过调控PKR信号通路来控制细胞凋亡的，M2能和p58及Hsp40相互作用，Hsp40是PKR信号通路的一个调控因子，它能与一种抑制PKR的细胞抑制因子p58（IPK）相互作用来调控PKR信号通路，M2通过与Hsp40和P58（IPK）形成一个稳定的复合物，抑制Hsp40-P58（IPK）的分离，最终导致了PKR的活化，诱导了细胞凋亡，从而控制病毒的复制[29]。

6 小结

历史上曾多次暴发流感大流行，对人类及家畜等造成了严重危害，而近年来出现的新H1N1、H5N1和H7N9等不同亚型造成的损失更是无法估量，疫苗及药物的研究是目前防控流感的主要措施，而M2蛋白由于其保守性和自身特性而成為疫苗及药物研究的热门。对类病毒颗粒疫苗的研究，由于其高效及安全性，有望成为M2疫苗研究的重点，而最近发现的具有中和活性的单结构域M2抗体，则为发展新型M2抗体提供了新思路，鉴于M2蛋白在质子传导、药物作用、出芽等过程中所起的作用，开发针对性的药物有助于病毒感染的控制。

疫苗及药物的研究离不开M2蛋白结构及其功能机制的探索，虽然近年来M2蛋白的研究不断深入，但仍有许多问题有待进一步的研究，比如，如何发展能用于实际预防的基于M2的“通用疫苗”？基于M2的新型抗耐药性药物的研究？M2协调自噬和凋亡的确切机制？相信随着新技术与新方法的不断出现与应用，这些问题能被合理地阐述与解决，为流感的预防与治疗提供基础。

[参考文献]

[1] Rossman JS，Jing X，Leser GP，et al. Influenza virus M2 protein mediates ESCRT-independent membrane scission [J]. Cell，2010，142（6）：902-913.

[2] Mardanova ES，Kotlyarov RY，Kuprianov VV，et al. Rapid high-yield expression of acandidateinfluenza vaccine based on the ectodomain of M2 protein linked to flagellin in plants using viral vectors [J]. BMC Biotechnol，2015，15（1）：42-51.

[3] Wu F，Huang JH，Yuan XY，et al. Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus [J]. Vaccine，2007， 25（52）：8868-8873.

[4] Lee YN，Kim MC，Lee YT，et al. Cross protection against influenza A virus by yeast-expressed heterologous tandem repeat M2 extracellular proteins [J]. PLos One，2015，10（9）：1-19.

[5] Ravin NV，Kotlyarov RY，Mardanova ES，et al. Plant-produced recombinant influenza vaccine based on virus-like HBc particles carrying an extracellular domain of M2protein [J]. Biochemistry（Mosc），2012，77（1）：33-40.

[6] Zeng W，Tan AC，Horrocks K，et al. A lipidated form of the extracellular domain of influenza M2 protein as a self-adjuvanting vaccine candidate [J]. Vaccine，2015，33（30）：3526-3532.

[7] Lee YN，Kim MC，Lee YT，et al. Co-immunization with tandem repeat heterologous M2 extracellular proteins overcomes strain-specific protection of split vaccine against influenza A virus [J]. Antiviral Res，2015，122：82-90.endprint

[8] Lee YN，Kim MC，Lee YT，et al. Mechanisms of cross-protection by influenza virus M2-based vaccines [J]. Immune Netw，2015，15（5）：213-221.

[9] Wei GW，Meng WX，Guo HJ，et al. Potent neutralization of influenza A virus by a single domain antibody blocking M2 ion channel protein [J]. PLoS One，2011，6（12）：e28309.

[10] Rossman JS，Lamb RA. Influenza virus assembly and budding [J]. Virology，2011，411（2）：229-236.

[11] Hong M，Degrado WF. Structural basis for proton conduction and inhibition by the influenza M2 protein [J]. Protein Sci，2012，21（11）：1620-1633.

[12] Acharya R，Carnevale V，Fiorin G，et al. Structure and mechanism of proton transport through the transmembrane tetrameric M2 protein bundle of the influenza A virus [J]. PNAS，2010，107（34）：15075-15080.

[13] Dong H，Yi M，Cross TA，et al. Ab initio calculations and validation of the pH-dependent structures of the His37-Trp41 quartet，the heart of acid activation and proton conductance in the M2 protein of Influenza A virus [J]. Chem Sci，2013，4（7）：2776-2787.

[14] Polishchuk AL，Lear JD，Ma C，et al. A pH-dependent conformational ensemble mediates proton transport through the influenza A/M2 protein [J]. Biochemistry，2010， 49（47）：10061-10071.

[15] Cady S，Wang T，Hong M. Membrane-dependent effects of a cytoplasmic helix on the structure and drug binding of the influenza virus M2 protein [J]. J Am Chem Soc，2011，133（30）：11572-11579.

[16] Pielak RM. Mechanism of drug inhibition and drug resistance of influenza A M2 channel [J]. PNAS，2009，106（18）：7379-7384.

[17] Schnell JR，Chou JJ. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus [J]. Nature，2008， 451（7178）：591-595.

[18] Cady SD，Schmidtrohr K，Wang J，et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers [J]. Nature，2010，463（7281）：689-692.

[19] Khurana E， Devane RH，Dal PM，et al. Computational study of drug binding to the membrane-bound tetrameric M2 peptide bundle from influenza A virus [J]. Biochim Biophys Acta，2011，1808（2）：530-537.

[20] Georgieva ER，Borbat PP，GrushinK，et al. Conformational response of influenza A M2 transmembrane domain to amantadine drug binding at low pH（pH 5.5）[J]. Front Physiol，2016，7：317-328.

[21] Furuse Y，Suzuki A，Oshitani H. Large-scale sequence analysis of M gene of influenza A viruses from different species：Mechanisms for emergence and spread of amantadine resistance [J]. Antimicrob Agents Chemother，2009， 53（10）：4457-4463.endprint

[22] Gleed ML，Busath DD. Why bound amantadine fails to inhibit proton conductance according to simulations of the drug-resistant influenza A M2（S31N）[J]. J Phys Chem B，2015，119（3）：1225-1131.

[23] Li F，Ma CL，Degrado WF，et al. Discovery of highly potent inhibitors targeting the predominant drug-resistant S31N mutant of the influenza A virus M2 proton channel [J]. J Med Chem，2016，59（3）：1207-1216.

[24] Reycarrizo M，Barniolxicot M，Ma CL，et al. Easily accessible polycyclic amines that inhibit the wild-type and amantadine-resistant mutants of the M2 channel of influenza A virus [J]. J Med Chem，2014，57（13）：5738-5747.

[25] Bastian T，Stefanie S，Andreas H，et al. Acylation and cholesterol binding are not required for targeting of influenza A virus M2 protein to thehemagglutinin-defined budozone [J]. FEBS Letters，2014，588（6）：1031-1036.

[26] Zhirnov OP，Klenk HD. Influenza A virus proteins NS1 and hemagglutinin along with M2 are involved in stimulation of autophagy in infected cells [J]. J Virol，2013，87（24）：13107-13114.

[27] Gannagé M，Dormann D，Albrecht R，et al. Matrix protein 2 of influenza A virus blocks autophagosome fusion with lysosomes [J]. Cell Host Microbe，2009，6（4）：367-380.

[28] Beale R，Wise H，Stuart A，et al. A LC3-interacting motif in the influenza A virus M2 protein is required to subvert autophagy and maintain virion stability [J]. Cell Host Microbe，2014，15（2）：239-247.

[29] Guan ZH，Liu D，Mi S，et al. Interaction of Hsp40 with influenza virus M2protein：implications for PKR signaling pathway [J]. Protein Cell，2010，1（10）：944-955.

（收稿日期：2017-08-02 本文編辑：张瑜杰）endprint