基于网络药理学探讨土茯苓治疗银屑病的作用机制

狄伟，吴然，文昌晖，唐挺，贾敏，孟夏

(1.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳)

0 引言

土茯苓，根茎入药，性平无毒，味甘、淡，归肝、胃经，《本草纲目》记载本药具有“健脾胃，强筋骨，祛风湿，利关节，治拘挛骨痛，恶疮痈肿......”。现代研究表明[1]，土茯苓含有黄酮、鞣质、生物碱等有效成分，具有抗炎、免疫抑制、抑菌抗菌、抗肿瘤等作用，广泛应用于治疗皮肤科疾病，对银屑病的治疗有其独特之处。然而，土茯苓中的药物成份种类繁多，仅通过研究土茯苓中的单一成份物质在银屑病治疗中的机制，只可说明其部分药效物质基础，很难完全阐明其全部的科学内涵。

银屑病，俗称“牛皮癣”，相当于古中医“白疕”、“松皮癣”范畴，是一种自身免疫紊乱性皮肤病，受多基因调控和多环境要素影响，在我国的发病率约为0.47%[2]，其发病机制比较复杂，研究发现，银屑病的发病是遗传和免疫共同作用的结果，涉及基因组学、蛋白组学、代谢组学、细胞因子组学以及内分泌免疫等多个环节[3-5]。除此之外，银屑病的发生还受生活习惯、环境质量以及外伤等多种因素的影响。因此，通过多路径对银屑病的治疗进行相关研究显得尤为重要。

网络药理学作为一门新兴学科，是基于系统生物学和系统药理学的研究理论，将药物成分靶点与生物靶点形成互作网络，从而更加全面、系统的研究药物的机理[6]。本论文通过使用网络药理学的研究方法，归纳总结了土茯苓在银屑病治疗中的关键成分及靶点，进一步通过系统生物学的方法进行相关分析，深入探讨了土茯苓关键药物成分-靶点-通路之间的相互作用，为探索土茯苓治疗银屑病的机制提供新的思路。

1 方法

1.1 土茯苓成分收集与筛选

选定“土茯苓”中药名为查询关键词，在传统中药系统药理学数据库和分析平台 TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中检索土茯苓的所含的化学成分。以用口服生物利用度(oralbioavailability，OB) 和类药性(drug-like，DL) 为关键指标[7]，其中OB 值≥30%，是评价药物能否发挥作用的重要指标，DL 值≥0.18 代表药物化学成分与已知化学药的相似性，对确定中药化学成分是否对机体产生活性具有重要参考意义[8]。

1.2 相关靶点信息的收集

以 Drugbank 数据库(https://www.drugbank.ca/) 为工具，将筛选得到的土茯苓有效成分，进行蛋白靶点的匹配，得到土茯苓有效成分结构所对应的靶点蛋白，再以Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/)为工具，查询靶点蛋白相对应的基因，并对其归纳、整理。在 TTD 数据库(https://db.idrblab.org/ttd/)和 OMIM 数据库(http:// www.omim.org/)中，检索与银屑病相关的靶点基因。

1.3 网络模型的构建和分析

将筛选得到的土茯苓有效化学成分与 Drugbank 中得到的靶点蛋白进行总结整理，相关数据通过 Cytoscape 3.6.0 软件进行网络构建，得到土茯苓有效成分靶点网络。将OMIM数据库和TTD 数据库中检索的银屑病相关靶点基因整理，相关数据通过 Cytoscape 3.6.0 软件并使用Bisogenet 插件构建疾病-蛋白互作网络。通过Cytoscape 3.6.0 中的 Merge 功能将前面2 个网络合并，得到土茯苓在银屑病的治疗中，有可能发挥作用的靶点。通过MAS 3.0 系统将所得到的潜在靶点进行基因本体(GO)分类富集分析和KEGG 通路分析。GO 分类富集分析包括分子功能分析、生物学过程分析、细胞组分分析[9]。最后，通过以上分析，将土茯苓有效成分与靶点通路相对应，形成有效成分-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 土茯苓活性成分的筛选

以“土茯苓”为关键词，通过TCMSP 数据库检索，共得到74 个化学成分，以口服生物利用度OB ≥30%和类药性DL ≥0.18 为检索条件，同时剔除无对应靶点的化学成分，最终得到15 个潜在的有效成分(见表1)。

表1 土茯苓潜在有效成分

2.2 靶点信息的收集和筛选

2.2.1 成分对应靶点信息的收集和筛选

图1 土茯苓活性成分-靶点-通路网络模型

图2 土茯苓治疗银屑病候选靶点的 GO 富集

图3 土茯苓治疗银屑病 KEGG 通路富集

将收集得到的土茯苓 15 个潜在有效成分导入到Drugbank 数据库中配对得到了 326 个蛋白，将所对应的靶点蛋白通过 Uniprot 数据库查询其对应的基因。在 GeneCards数据库和 OMIM 数据库检索与银屑病相关的基因，其中在GeneCards 数据库中检索到 3202 个靶点，在 OMIM 数据库中检索到 12 个靶点，合并筛去重复靶点，将这些靶点导入到Cytoscape 3.6.0 软件，运用 Bisogenet 插件构建疾病蛋白相互作用网络。将此网络与土茯苓主要活性成分靶点网络运用Cytoscape 3.6.0 中的 Merge 功能相映射，取交集部分最终获得56 个土茯苓治疗土茯苓的靶点。将得到的56 个靶点制成靶点间相互作用网络图，结果见图 1。从图 1 中可看出这 56 个靶点间有相互作用，表明可能在某种层面上这些靶点是相互联系的并通过多途径、多方面的协调起到治疗银屑病的作用。

2.2.2 生物功能通路分析

为更进一步探究其作用通路，将所得的56 个靶点导入到MAS 3.0 系统中进行GO 分类富集分析(图2)和KEGG 生物路径分析(图3)，列出分析结果排名前20 的路径。其中GO分类富集分析包括分子功能分析、细胞组分分析、生物学过程分析，从图2 中可以看出在分子功能层面上，土茯苓对蛋白质异二聚活性、泛素样蛋白连接酶结合等等影响较大；在细胞组分中，土茯苓对细胞核、细胞质、细胞膜等影响较大；在生物学过程中，土茯苓对酶激活、辅酶结合、蛋白激酶调节活性、氧化还原酶活性等影响较大。图3 结果显示，土茯苓治疗银屑病主要涉及的排名前20 的通路为PI3K-Akt 信号通路、蛋白聚糖信号通路、小分子核糖核酸通路、MAPK 信号通路等。

2.2.3 土茯苓活性成分-靶点-通路网络模型

将富集分析得到的排名前 20 的通路对应土茯苓治疗银屑病的靶点及成分，构建“成分-靶点-信号通路”网络模型。图4 中紫色节点代表土茯苓中的活性成分，绿色节点代表潜在靶点，图5 柱状图可以直观的看出排名靠前的靶点基因为：IL6、EGFR、VEGFA 为网络中的关键节点，表明它们可能是土茯苓治疗银屑病的核心作用靶点。每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了土茯苓多成分、多靶点治疗银屑病的作用机制。同时多条通路之间是通过共有靶点连接而非独立分开的，表明各条通路之间可发挥协同作用起到治疗银屑病的作用。

3 讨论

本研究通过网络药理学的方法法探讨了土茯苓治疗银屑病的作用机制，发现该药可能通对酶激活、辅酶结合、蛋白激酶调节活性、氧化还原酶活性等生物过程，并对蛋白质异二聚活性、泛素样蛋白连接酶结合等产生作用，其主要机制与PI3K-Akt 信号通路、蛋白聚糖信号通路、小分子核糖核酸通路、MAPK 信号通路等有关。

银屑病的发病机制具体不详，目前多认为与炎症反应、免疫调节及遗传等都有一定的相关性。本研究共预测得到IL6、EGFR、VEGFA 等56 个土茯苓治疗银屑病的关键靶点。其中，IL-6 在炎症以及B 细胞成熟的过程中发挥了重要的作用，并具有多种生物学功能，其主要在急性或者慢性炎症部位产生，在血清中分泌并通过IL-6 受体诱导表达，在B 细胞最终分化成免疫球蛋白发挥重要作用。Blauvelt[10]通过IL-17c 驱动的IL-6 缺失小鼠模型，出现银屑病样皮损，证实了IL-6 参与了银屑病发病。EGFR 是上皮生长因子(EGF)信号转导的受体，EGFR 与肿瘤细胞的高侵袭性、增殖、转移关系、血管新生以及抑制细胞凋亡密切相关。Tan F 等[11]研究了盐酸伊考替尼对表皮生长因子受体(EGFR)信号转导及对银屑病动物模型的影响，证实了盐酸伊考替尼通过阻断EGFR 信号通路，达到治疗银屑病的目的。VEGFA 属于PDGD/VEGF 生长因子家族的一员，在血管生成、血管发生和内皮细胞生长中发挥作用，可以诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制凋亡并诱导血管通透性。Young HS 等[12]研究证实血管内皮生长因子A (VEGFA)在银屑病患者的皮肤病中表达增加，其中两个VEGFA 单核苷酸多态性位点与早发性银屑病相关(出现于40 岁之前)。

图4 土茯苓治疗银屑病的靶点相互作用网络

图5 茯苓活性成分-靶点-通路柱状图

综上所述，本文通过运用网络药理学的研究方法，探讨了土茯苓治疗银屑病的可能作用机理，阐述了土茯苓多药物成分-多作用靶点的复杂网络关系，为进一步系统地开展土茯苓治疗银屑病的实验研究及临床应用提供理论依据。