复方茵丹汤对HepG2细胞NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因沉默后MRP2和RXRα表达的影响*

李晓玲 孙凤霞 朱 达 徐 萌 罗明理 王傲然

首都医科大学附属北京中医医院感染科 (北京, 100010)

胆汁淤积是由于各种原因造成胆汁形成、分泌和排泄障碍，胆汁流进十二指肠受阻，进而流入血液的一种病理状态，临床有瘙痒、乏力、尿色加深、黄疸等症状，早期可无明显症状，仅表现为ALP和GGT水平升高，病情进展后可出现高胆红素血症，严重者可导致肝衰竭甚至死亡[1]。核因子κB(NF-κB)、早期生长反应因子(Egr-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)和维甲酸X受体α(RXRα)的差异表达和调控对于胆汁淤积的发病及治疗起着至关重要的作用[2-5]。胆汁淤积归属于中医学“黄疸”范畴，复方茵丹汤由茵陈蒿汤加减化裁而来，具有清热化湿、凉血活血的功效。我们在前期通过体外异硫氰酸-α-萘酯诱导急性肝内胆汁淤积(AIC)大鼠动物模型，复方茵丹汤能够显著降低AIC大鼠AST、ALT、GGT、ALP、TBA水平，通过调控ICAM-1、Egr-1和MRP2 mRNA和蛋白的表达水平来减轻胆汁淤积[6-8]。本研究采用体外实验探讨复方茵丹汤对NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因沉默HepG2 细胞中MRP2及其核受体RXRα的基因和蛋白表达水平的影响，以期阐明复方茵丹汤治疗胆汁淤积的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器 人肝癌细胞HepG2细胞购自北京市理化分析测试中心。MTT、1640培养基(No.11875093)购自Gibco公司；大鼠NF-κB、ICAM-1、Egr-1的siRNA基因套装购自Invitrogen公司；Trizol试剂(DP405-02)购自北京天根生化科技有限公司，反转录和荧光定量PCR试剂盒(RR047B)购自TaKaRa公司，NF-κB抗体(111035003)、ICAM-1抗体(115035003)、Egr-1抗体(REK0005)购自Jackson公司，MRP2抗体(PA5-23653)、RXRα抗体(PA5-29165)购自Thermo公司，HRP标记的羊抗兔IgG(ZB2306)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PageRuler Prestained Protein Ladder(SM0671)购自Fermentas公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(300000-B)购自北京赛驰生物科技有限公司，eECL Western Blot Kit高灵敏度化学发光检测试剂盒(CW0049)购自北京康为世纪生物科技有限公司。低温高速离心机(日立，CF16RXⅡ)，DYY-6C型电泳仪，全波长扫描式多功能读数仪(Thermofisher)，BIO-RAD Mini-TRANS-BLOT CELL，DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳槽，TS-1 脱色摇床(太仓市实验设备厂)，生物分子成像仪(日本富士LAS-4000 MINI)。

1.2 药品 复方茵丹汤由茵陈30 g，大黄10 g，栀子、生地黄、白术、茯苓各15 g，赤芍12 g，牡丹皮9 g组成，方中药物剂量为70 kg 成人一日用量；所有药物均由首都医科大学附属北京中医医院中药房统一采购，由北京市卫生局临床药学研究所煎制成生药含量为2.448 g/ml的药液。熊去氧胆酸胶囊(UDCA，商品名：优思弗)，德国Losan Pharma GmbH公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 HepG2细胞培养 将HepG2细胞接种于含有10%胎牛血清(FBS)的1640培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，转染前24 h换用无血清培养基过夜。

1.3.2 复方茵丹汤对HepG2细胞增殖抑制率测定 细胞按常规消化终止后用生长培养基调整细胞密度为1×105个/ml，按100 μl/孔铺于96孔细胞培养板，24 h后分别更换为含不同浓度复方茵丹汤(20%、10%、5%、2.5%、1.25%)培养基采用MTT法检测细胞增殖情况，药物作用24 h后弃掉细胞原培养基，加入含10 μl MTT溶液的1640培养基100 μl，37℃孵育4 h后弃掉MTT反应液，用10% SDS 充分溶解结晶，读取570 nm吸光值，并计算细胞增殖抑制率，细胞抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。选择增殖抑制率小于10%的药物浓度作为最大无毒浓度进行后续实验。

1.3.3 细胞分组与给药 细胞按常规消化终止后用生长培养基调整细胞密度为1×105个/ml，按10 ml/皿铺于细胞培养皿(直径100 mm)，并分为空白对照组(正常培养的HepG2细胞)、复方茵丹汤组、UDCA组、转染组、转染+复方茵丹汤组。待细胞生长密度达到60%～70%时，用2%低血清培养液饥饿处理12 h，空白对照组细胞加入终浓度为0.1% 的二甲基亚砜(DMSO)，复方茵丹汤组细胞加入含2%复方茵丹汤的培养基，UDCA组细胞加入终浓度为100 mol/L(含DMSO 0.1%) 的UDCA，转染组细胞加入siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1，转染+复方茵丹汤组细胞加入siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1和含2%复方茵丹汤的培养基。

1.3.4 Real-time PCR检测复方茵丹汤对HepG2细胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα基因的影响 按Trizol试剂说明书方法提取HepG2细胞总RNA，按Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书方法逆转录成cDNA。荧光定量PCR检测按 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行。反应条件：95℃预变性5 min，95℃、50℃、72℃ 30s，72℃延伸7min，30个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blot检测复方茵丹汤对HepG2细胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα蛋白的影响 参照文献[9]提取细胞总蛋白和核蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。每个样本上样总量为20 μg，蛋白质预染Marker上样量为7 μl。核蛋白30 μl、总蛋白50 μl用10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离，转至PVDF膜。用5% 脱脂奶粉溶液(TBST)室温振摇封闭2 h，然后加入NF-κB一抗(1∶300)、ICAM-1一抗(1∶2 000)、Egr-1一抗(1∶1 000)、MRP2一抗(1∶500)、RXRα一抗(1∶2 000)、GAPDH一抗(1∶800)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入相应二抗(1∶1 000)室温振摇反应1 h，TBST洗膜5 min×4次。加入化学发光试剂，经显影、定影后，胶片进行扫描，用Quantity One图像分析系统分析目标带的净光密度值。

1.3.6 Real-time PCR和Western blot检测复方茵丹汤对siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1转染的HepG2细胞中MRP2和RXRα基因和蛋白水平的影响 siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1引物购自Invitrogen公司，序列见表2。按照1.3.5和1.3.6方法检测siRNA转染的HepG2细胞中MRP2和RXRα基因及蛋白表达水平检测。

表2 siRNA序列信息

2 结果

2.1 不同浓度复方茵丹汤对HepG2细胞的生长抑制作用 20%复方茵丹汤对HepG2细胞的生长抑制率为(71.62±0.04)%，10%复方茵丹汤对HepG2细胞的生长抑制率为(73.64±0.04)%，5%复方茵丹汤对HepG2细胞的生长抑制率为(15.50±0.06)%，2.5%复方茵丹汤对HepG2细胞的生长抑制率为(3.80±0.05)%，1.25%复方茵丹汤对HepG2细胞的生长抑制率为(3.18±0.04)%，因此选择2%复方茵丹汤进行后续实验。

2.2 复方茵丹汤对HepG2细胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα基因和蛋白水平的影响 与空白对照组比较，复方茵丹汤组和UDCA组NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因和蛋白水平明显降低(P<0.01，P<0.05)，MRP2和RXRα基因和蛋白水平明显升高(P<0.01，P<0.05)，复方茵丹汤对HepG2细胞NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα表达的诱导作用明显强于UDCA组(P<0.01，P<0.05)。见表3、表4和图1。

表3 各组HepG2细胞基因相对表达量变化

表4 各组HepG2细胞蛋白相对表达量变化

空白对照组 复方茵丹汤组 UDCA组图1 复方茵丹汤影响HepG2细胞中相关蛋白表达

2.3 复方茵丹汤对siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1、siRNA-Egr-1转染的HepG2细胞中MRP2和RXRα基因和蛋白水平的影响

见表5、表6和图2。

表5 复方茵丹汤对siRNA转染细胞NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα对表达量的影响

表6 复方茵丹汤对siRNA转染细胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1、MRP2和RXRα蛋白相对表达量的影响

图3 复方茵丹汤影响siRNA转染细胞中相关蛋白表达

3 讨论

ICAM-1是存在于细胞表面的一类具有复杂功能的糖蛋白，介导细胞间的相互黏附、参与众多的生理、病理过程。研究发现，胆汁淤积时，野生小鼠的静脉窦、门静脉和肝细胞可以观察到ICAM-1表达的增加[10]，其发生机制可能是胆红素和胆盐通过活化Kupffer细胞，活化的Kupffer细胞进一步释放IL-1、TNF-α等炎症介质，最终诱导ICAM-1表达上调[11]。NF-κB和Egr-1是一种对胆汁淤积的炎症和损伤有重要意义的转录因子，广泛存在于体内，参与多种靶基因的表达调控，如细胞因子、化学趋化因子、生长因子、某些急性期反应蛋白以及参与免疫识别的受体和抗原递呈的蛋白质等，大多数均参与宿主的免疫和炎症反应[12]，是早期炎性调节的关键转录因子。研究显示NF-κB和Egr-1是胆管结扎所致梗阻性胆汁淤积过程中肝细胞损伤的重要启动因子[13]，胆管结扎致胆汁淤积后,胆汁酸浓度升高,通过激活表皮生长因子受体(EGFR)而上调肝细胞中NF-κB和Egr-1，NF-κB和Egr-1通过直接或间接作用增加促炎介质ICAM-1的表达，从而导致中性粒细胞在肝脏聚集、活化而损害肝细胞。肝细胞和胆管细胞摄取和分泌胆汁成分的功能，依赖细胞膜上的转运蛋白分子。这些转运蛋白分子中，参与胆红素排泄的转运蛋白主要为MRP2[14]。研究表明，MRP2在肝细胞膜的毛细胆管面上表达水平最高，其生理功能是将葡萄糖醛酸结合型胆红素及其他双亲性双价阴离子主动转运至细胞外[15]。RXRα是肝细胞细胞核激素受体(NHR)超家族中的重要一员，作为一种可被配体激活的转录因子，在全身各处均有表达，RXRα参与了调控胆汁酸的转运。胆汁淤积时，RXRα作为配体与其他多种核受体结合形成异二聚体，间接调控胆汁酸的排泄[16]。RXRα可以与其伙伴核受体FXR、CAR等结合形成异源二聚体，参与MRP2 mRNA转录的正向调控[17]。研究发现，核转录因子NF-κB、Egr-1及其靶基因炎症因子ICAM-1共同参与了肝细胞转运蛋白MRP2及其核受体RXRα基因的表达调控[18]。

HepG2细胞是一种极性化细胞，易于培养，可缩短实验周期，体外实验中常选用其代替原代细胞[5]，因此，本研究选用HepG2细胞系利用siRNA转染沉默NF-κB、ICAM-1、Egr-1的技术，观察复方茵丹汤对HepG2细胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1的沉默与否，其下游的靶基因MRP2和核受体RXRα的表达，及其编码的靶蛋白的变化。结果发现，复方茵丹汤能显著降低siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1和siRNA-Egr-1转染后HepG2细胞中NF-κB、ICAM-1、Egr-1基因和蛋白的表达水平，提高siRNA-NF-κB、siRNA-ICAM-1和siRNA-Egr-1转染后HepG2细胞膜转运蛋白MRP2和核受体RXRα mRNA和蛋白水平的表达。复方茵丹汤可在细胞水平上调肝细胞膜转运蛋白MRP2及其核受体RXRα mRNA和蛋白水平的表达，NF-κB、ICAM-1、Egr-1参与了这一调控过程。复方茵丹汤是否还通过其他途径减轻胆汁淤积仍有待深层次的研究。