瑞婷单药或联合创盈用于大鼠EMS治疗效果研究

薛 宇，张 燕，胡玉红，夏百荣，季庆辉

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学附属第二医院,黑龙江 佳木斯 154002;3.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院,黑龙江 哈尔滨 150081)

子宫内膜异位症(endometriosis)子宫内膜活性细胞由于种植、侵袭、转移等原因，生长在子宫体以外的位置又称内异症，多见于育龄期女性妇科疾病之一[1]。目前内异症发病机制具有多种说法，现在广泛认可种植学说。子宫内膜活性细胞可以侵犯身体的任何部位，侵犯主要部位是盆腔脏器、壁腹膜。子宫内膜活性细胞侵犯身体主要部位顺序:卵巢、宫骶韧带、子宫、其它脏腹膜、阴道直肠膈、其它部位，临床重要表现为盆腔黏连、疼痛、不孕。内异症青春期前不发生，主要发生在女性生育期，女性绝经后异位病灶就开始逐渐退化萎缩变小，女性妊娠期或应用性激素抑制卵巢分泌雌激素，就可以暂时阻止内异症发展，子宫内膜异位症是妇科常见疾病之一主要是依赖激素发病[2,3]。

瑞婷(RuiTing)(化学名：a，a，a&rsquo；a&rsquo；-四甲基-5-(1H-1，2，4-三唑-1-基甲基)-1，3-二乙氰苯，既阿那曲唑)是强效选择性非甾体类芳香化酶抑制剂，由于是芳香化酶抑制剂其可以抑制育龄期妇女体内肾上腺生成雄烯二酮转化为雌酮，这样血浆雌激素明显地降低，从而达到抑制内异增生部位生长的作用，也就起到了治疗异位症效果。

创盈(Cusuan Jiaqiangyuntong Pian)(6α-甲基-17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮醋酸酯，既醋酸甲羟孕酮)是孕激素类药物，创盈主要作用在子宫内膜，机制原理是通过下丘脑负反馈，从而抑制垂体前叶的促黄体生成激素释放作用，抑制卵巢等雌激素生成，达到雌激素水平下降，异位症是激素依赖性妇科疾病之一，所以，创盈就起到了治疗异位症效果。

探索瑞婷单药或联合创盈用于大鼠EMS治疗作用机制原理及大鼠EMS相关变化情况。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

实验动物：佳木斯大学实验动物中心提供雌性性成熟未孕大鼠50只，饲养环境温度18～20℃，相对湿度40%～50%，体质量(210±10.0)g。

实验试剂：瑞婷(阿那曲唑片)(规格：1.0mg，重庆华邦制药有限公司，国药准字H20020194)；创盈(醋酸甲羟孕酮片)(规格：2mg，北京斯利安药业有限公司，国药准字H11021562)。

实验仪器：THZ-24空气浴恒温摇床(上海市闵行区：上海赫田科学仪器有限公司)； TM5R自动脱帽离心机(江苏省盐城市亭湖区：盐城市凯特实验仪器有限公司)；TG18.5台式高速离心机(上海浦东新区周浦镇：上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；ZDP-9902电热恒温培养箱(上海浦东：上海喆图科学仪器有限公司 )；Varioskan LUX多功能酶标仪(中国(上海)自由贸易试验区：赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；大鼠TNF-α试剂盒(上海市青浦区：今品化学技术(上海)有限公司)；大鼠血管内皮生长因子C(VEGF-C)ELISA试剂盒96TMB-6733B(上海闵行区：上海西唐生物科技有限公司)，大鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒(南京市江宁区：南京森贝伽生物科技有限公司)；安一牌0-150-200-300mm高精度游标卡尺(桂林市七星区：桂林安一量具股份有限公司)。

1.2 EMS模型大鼠构建方法

大鼠动情期检查采用阴道涂片检查方法，每日进行实验大鼠阴道涂片检查。实验大鼠经阴道涂片检查后选择动情周期连续2个大鼠，选择实验大鼠在第3个动情周期时运用人工诱导法构建EMS模型，应用消毒、剖腹、自体移植、关腹缝合手术几个重要环节人工诱导法建在构EMS大鼠模型。

1.3 EMS大鼠构建模型诊断标准

EMS模型大鼠构建后第4个动情周期时进行消毒、剖腹、检查模型构建情况，EMS模型大鼠诊断标准[4]：腹壁移植处异位移植物增大显著，形态呈囊状或结节状内部含有大量透明态液体，囊状或结节表面具有增生结缔组织并且分布有粗细不等柔软血管。

1.4 实验EMS大鼠各处理方法及分组

选择建模成功EMS模型大鼠45只，随机进行三种处理分组。A组：瑞婷组；B组：瑞婷联合创盈组；C组：对照组。三组处理给药情况：A组：瑞婷(瑞婷溶0.9 %氯化钠1mL 0.1mg/kg·d)灌胃连续3周；B组：瑞婷(瑞婷溶0.9 %氯化钠1mL 0.1 mg/kg·d)+ 创盈(创盈溶0.9 %氯化钠1mL 4 mg/kg·d)灌胃连续3周；C组：0.9 %氯化钠1mL灌胃连续3周。

1.5 实验EMS大鼠腹壁移植处异位囊肿内膜取样

A组：瑞婷组；B组：瑞婷联合创盈组；C组：对照组三组处理灌胃连续3周后，三组处理实验EMS大鼠禁食24h，运用消毒、剖腹方法，在实验EMS大鼠腹壁移植处异位囊肿内膜用手术小剪子取异位病灶囊泡处内膜组织，三组处理分别取样后放入保存福尔马林液中进行后期各种检测，血液采用股动脉血液取样。

1.6 实验EMS大鼠测量计算移植法处理异位病灶囊肿体积变化

用安一牌高精度数显电子卡尺0-150-200-300mm游标卡尺测量移植法处理实验EMS大鼠异位病灶囊肿体积，计算移植法处理异位病灶囊肿体积变化情况。

1.7 实验EMS大鼠血清中雌二醇(E2)、异位内膜VEGF 和TNF-α水平检测操作

瑞婷单药或联合创盈等三处理异位病灶样品必须按大鼠雌二醇(E2)ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)、大鼠TNF-α试剂盒(今品化学技术(上海)有限公司)、大鼠血管内皮生长因子C(VEGF-C)ELISA试剂盒96TMB-6733B(上海西唐生物科技有限公司)产品说明书进行检测。

1.8 瑞婷单药或联合创盈治疗实验EMS大鼠数据统计方法

瑞婷(瑞婷溶0.9%氯化钠1mL 0.1mg/kg·d)+ 创盈(创盈溶0.9%氯化钠1mL 4mg/kg·d)等三处理所得数据应用SPSS19.0 软件处理分析，采用t检验方法进行处理间比较。

2 结果

2.1 瑞婷单药或联合创盈治疗实验EMS大鼠移植法计算建模异位囊肿体积

用安一牌高精度数显电子卡尺0-150-200-300mm游标卡尺测量移植法处理实验EMS大鼠，种植建模手术28只囊肿明显、透明液体具有淡黄色；10只囊肿略有均符合建模评定标准，计算移植法处理异位病灶囊肿体积变化见表1。

表1 实验EMS大鼠移植法异位囊肿体积(mm3)

2.2 瑞婷单药或联合创盈治疗实验EMS大鼠异位囊肿病灶光镜形态观察

瑞婷单药或联合创盈治疗实验EMS大鼠，通过光学显微镜进行瑞婷单药或联合创盈治疗实验EMS大鼠异位囊肿病灶观察，瑞婷联合创盈治疗实验EMS大鼠异位囊肿病灶恢复具有显著效果。瑞婷联合创盈治疗实验EMS大鼠异位囊肿病灶光镜形态观察见表2。

表2 瑞婷单药或联合创盈治疗实验EMS大鼠异位囊肿病灶光镜形态观察

2.3 瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠病灶肉眼观察形态变化

瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠处理后，对照组治疗前后没有变化，瑞婷单药或联合创盈比瑞婷单药治疗EMS大鼠效果显著。瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠后腹部异位病灶肉眼观察形态变化见表3。

表3 瑞婷单药或联合创盈治疗治疗EMS大鼠后腹部异位肉眼观察形态变化

2.4 瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠异位病灶体积前后比较

EMS大鼠腹部异位病灶呈现病理性增殖并且体积是越来越大，瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠异位病灶体积前后比较。瑞婷(瑞婷溶0.9%氯化钠1mL 0.1mg/kg·d)；瑞婷(瑞婷溶0.9 %氯化钠1mL 0.1mg/kg·d)+ 创盈(创盈溶0.9%氯化钠1mL mg/kg·d)；0.9%氯化钠1mL三处理治疗均连续灌胃连续21d。瑞婷单药治疗前后对比效果明显(P<0.05)；瑞婷联合创盈治疗前后对比效果显著(P<0.05)。说明瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠有效，而瑞婷或联合创盈比单用瑞婷效果显著。瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠异位病灶体积前后比较见表4。

表4 瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠病灶前后体积变化

2.5 瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠异位病灶内膜VECF和TNF-α水平变化

瑞婷单药与对照组对比VECF 和TNF-α水平变化明显(P<0.05)；瑞婷联合创盈与对照组对比VECF 和TNF-α水平变化非常明显(P<0.05)；瑞婷联合创盈与瑞婷单药治疗比较有显著差异(P<0.05)。说明瑞婷联合创盈比瑞婷单药效果显著。瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠异位内膜VECF 和TNF-α水平变化见表5。

表5 瑞婷单药或联合创盈治疗EMS大鼠异位病灶内膜VECF和TNF-α水平变化

3 讨论

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是育龄期女性常发生具有恶性肿瘤特征良性病变。内异症是育龄女性最常见慢性疾病之一，治愈后复发率超过癌症高达到40% ～ 50%。子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)从发病特征上来说具有恶性肿瘤特点：无限性生长、浸润、种植、分化异常、复发、组织及器官异常、转移、恶变等。内异症发病特点：疼痛。内异症疼痛是患者最明显感觉，由局部向远端转移并且快速扩展。各种治疗愈后易复发。内异症各种治疗愈后极易复发并且出现暴瘦现象。子宫内膜异位症(endometriosis，EMS) 患者主要生理变化异位病灶内膜周围组织纤维化及周期性出血，异位囊肿经常在卵巢与子宫直肠陷凹及宫骶韧带三个部位发生，其它部位腹腔与胸腔及四肢等多处也可以发生[5]。国内外众多学者研究证明异位囊肿内膜生存及生长必须经过黏附，侵袭，生成血管三个过程，只有经过这样三个过程才能在异位引起病变形成症状[6]。血管内皮生长因子(VEGF)是具有促进血管内皮细胞生长高度特异性因子，其主要功能包括：诱导血管增生，促进形成新生毛细血管，增加血管通透性，促进血管生长四方面有利于血管生长及通透作用[7]。异位囊肿内膜VEGF含量水平与内异症发生发展有非常重要关系[8]。肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α)是促进细胞增殖和分化的重要炎症因子，其主要功能包括：肿瘤细胞杀伤或抑制，吞噬中性粒细胞能力提高，抗感染，髓样白血病细胞向巨噬细胞分化促进，细胞增殖和分化促进五方面有利于杀伤和抑制肿瘤细胞作用。异位囊肿内膜TNF-α含量水平与内异症发生发展有非常重要关系[9]。VEGF与TNF-α同时存在时，二者相互影响并共同促进异位囊肿内膜产生新血管和生长。瑞婷单药或瑞婷联合创盈都具有减少细胞合成，抑制内膜增生，促进内膜细胞凋亡三方面功能，通过大鼠EMS治疗二方面因子水平变化来评价效果[10]。

瑞婷单药或联合创盈治疗大鼠EMS通过用安一牌高精度数显电子卡0-150-200-300mm游标卡尺测量移植法处理结果表明，瑞婷单药或瑞婷联合创盈与对照比病灶体积明显变小，瑞婷联合创盈与瑞婷单药比较病灶体积变小明显。瑞婷具有抑制芳香化酶产生作用，芳香化酶减少必然降低雌激素水平，雌激素减少必然不刺激异位囊肿内膜细胞增长，可以起到治疗异位囊肿作用。创盈通过对下丘脑负反馈垂体前叶促黄体生成激素受抑制，卵巢排卵受抑制，雌激素形成减少也就同时起到治疗异位囊肿作用[11]。

瑞婷联合创盈治疗大鼠EMS腹部异位病灶肉眼观察形态变化，异位囊肿病灶明显萎缩，褶纹较多，囊肿内积液较少，腹部连带稍有，血管分布较少，腹部病灶变小；光学显微镜异位囊肿病灶形态观察，异位囊肿病灶明显萎缩，血管明显减少，间质细胞小而少，细胞萎缩扁平疏松，囊肿病灶内膜上皮显变薄；异位囊肿病灶体积瑞婷联合创盈与瑞婷单药治疗前后对比效果显著(P<0.05)；异位囊肿病灶内膜VECF 和TNF-α水平变化减少显著，通过实验证明瑞婷联合创盈治疗大鼠EMS效果非常好[12]。

瑞婷联合创盈治疗大鼠EMS效果比瑞婷单药效果显著，研究证明了这样结果。瑞婷治疗EMS患者皮肤、头发、胃肠等有不良反映，并且重者有忧郁、头痛或皮疹等出现，大多数患者能耐受瑞婷不良反映。瑞婷联合创盈治疗大鼠EMS可以减少或降低不良反映发生，为治疗和预防内异症治愈后复发探索种可行方法，在EMS患者临床应用方面还要进一步研究和探索。