霜期前后金银忍冬叶、枝条、果实中绿原酸含量测定

宋文琦

(佳木斯市中心医院， 黑龙江 佳木斯 154003)

金银忍冬Lonicera maackii(Rupr.) Maxim.又名金银木、王八骨头、胯杷果，为忍冬科忍冬属落叶灌木，金银忍冬除具有传统的提高免疫力、解热、抗炎的药用作用外，还具有抗氧化、保肝、抗肿瘤、降血糖等药用功效[1]，是一种具有巨大开发价值的中药新资源。近年来，众多研究工作者对金银忍冬进行了大量的研究，已经对金银忍冬不同部位进行了生药学鉴定[2]，生药学其成果涵盖从资源分布到药效成分、药理作用等多方面，均显示其化学成分非常丰富，其中绿原酸被认为是其主要的药效成分。绿原酸在对心血管系统的作用中，首先在降低血压方面起作用[3]。其次具有保护心血管系统作用[4]；在对内分泌系统方面的作用中，绿原酸减少糖尿病风险，和改善糖耐量的功效。另外，有报道称绿原酸有抵抗肥胖作用，其机制可能和体内脂肪的重新分布、调节血浆脂联素水平、上调肝脏中PPAR-α的表达、下调胆固醇和脂肪酸生物合成、脂肪酸的氧化有关[5，6]。同时绿原酸还具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗衰老[9]作用。金银忍冬多分布在我国东北地区，黑龙江地区分布尤其广泛，以黑龙江为例，霜期长，无霜期短，全年约有200余天处于霜期，初霜为9、10月份，霜期一直持续到来年春季，由于地域和气候的特殊性，使其果实成熟期常与霜期在时间上发生重叠，经历霜期的温度和环境变化是否对其有效成分的含量产生影响还未见报道。因此本文利用高效液相色谱法对霜降前后叶、枝条、果实中有效成分绿原酸进行含量测定，并首次进行霜降前后绿原酸含量对比，为建立金银忍冬的生药学质量提供依据、提高其利用率，从而为更好地开发利用金银忍冬资源提供可靠的理论依据。

1 实验材料及方法

1.1 材料

实验所用材料为自采的原植物新鲜材料，并经佳木斯大学药学院生药学教研室刘娟教授鉴定为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lon icera Linn)植物金银忍冬(Lonicera maackii(Rupr.) Maxim.)，取其叶、枝条和果实三个部分进行鉴别研究。

1.2 实验方法

1.2.1 药材样品的处理

取霜期前后分别采集的金银忍冬的叶、枝条和果实，清洗后用仪器烘干，使用切药钢刀将干燥后的药材切成约1～2cm厚的薄片，用粉碎机分别粉碎后备用。

1.2.2 绿原酸含量高效液相色谱测定方法的建立

1.2.2.1 色谱条件：色谱柱：Waters Symmetry C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87)，流速：1.0mL·min-1；检测波长：327nm，柱温：30℃；进样量：20μL。

1.2.2.2 对照品溶液的制备，精密称取经五氧化二磷干燥过夜的绿原酸对照品10.10mg置100mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液溶解后，再加50%甲醇至刻度，得浓度0.1010mg/mL的溶液。

1.2.2.3 供试品溶液的制备，精密称取金银忍冬叶、枝条、果实的粉末各5g(过四号筛)，置索氏提取器中，加三氯甲烷回流2h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干，加甲醇回流提取4h，提取液蒸干，残渣加甲醇-25%盐酸溶液(4:1)混合溶液25mL，加热回流30min，放冷，转移至50mL量瓶中，并加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

1.2.3 HPLC定量分析的方法学考察

1.2.3.3 标准曲线的绘制：精密吸取2.2.2项下绿原酸对照品溶液1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，依次进样，以进样量(μg)为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。

1.2.3.4 精密度实验:取绿原酸对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样5次，进样体积10μL，测定绿原酸峰面积积分值的RSD。

1.2.3.5 重复性实验: 按照含量测定项下的方法制备供试品溶液6份，进样量10μL测定绿原酸含量和峰面积积分值。

1.2.3.6 稳定性实验: 取9月30日降霜前采集的金银忍冬枝条作为供试品溶液，于0h，1.5h，3h，6h，12h，各进样10μL，测定绿原酸的峰面积和积分值。

1.2.3.7 加样回收率实验: 精密称取金银忍冬枝条的粉末6份各0.25g(过四号筛)，加绿原酸对照品溶液3.5mL，加50%甲醇溶液约35mL，超声处理(250W，频率35kHz)30min，静置放冷，再加50%甲醇至刻度，摇匀，过滤后即得。以进样量10μL，重复操作6组。测定绿原酸回收率的RSD。

1.2.4 金银忍冬药材样品测定

精密称取降霜前后金银忍冬叶、枝条、果实的药材粉末各0.5g，按照2.2.3项下方法制备供试液。注入液相色谱仪，在原下色谱条件测定，通过线性方程计算含量。

2 结果

2.1 绿原酸含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件的确定

对照品、供试品溶液的色谱图，见图1。

A.对照品；B.供试品

2.1.2 标准曲线的绘制

结果表明绿原酸在0.101～2.020μg(R2=0.9999)范围内呈良好的线性关系。可得到绿原酸的线性回归方程为：y=2.974×106x-1.401×105，并根据线性方程、相关系数及线性范围绘制绿原酸的标准曲线，见图2。

图2 绿原酸标准曲线

2.1.3 精密度考察

测定不同组分绿原酸的峰面，计算其RSD值为0.8%，见表1。

表1 绿原酸精密度实验结果

2.1.4 重复性考察

取同时期采集的金银忍冬果实6份制备供试品溶液，测定绿原酸的峰面积积分值为2.4%，见表2。

表2 绿原酸重复性实验结果

2.1.5 稳定性考察

从同一供试品溶液中取5个样品，在24h内分5个时间段测定山奈素的RSD为0.4%。可见24h内供试品溶液的稳定性良好。见表3。

表3 绿原酸稳定性实验结果

2.1.6 加样回收率考察

利用第三章相同的回收率公式算出山奈素的平均加样回收率为97.96%， RSD为1.5%，可见此方法准确度很高，回收率较好。见表4。

表4 山奈素加样回收率实验结果

2.2 金银忍冬样品测定

金银忍冬绿原酸的含量测定：利用线性方程计算霜降前、霜降时和霜降后不同时期的金银忍冬叶、枝条、果实中绿原酸的含量，见表5。

表5 不同时期金银忍冬叶、枝条、果实中绿原酸含量测定

2.3 金银忍冬经霜期绿原酸含量的统计描述

根据测量的数据，对三个不同时期绿原酸的含量进行统计，显示出金银忍冬不同部位绿原酸含量的差异，和降霜对金银忍冬叶、枝条、果实中绿原酸含量的影响。绿原酸在枝条中的含量最高为1.487%，在果实中的含量最低为0.294%，均值为1.084%。

3 讨论

绿原酸在金银忍冬中的含量是比较大的，本实验中测定波长的前期实验中，以327nm作为绿原酸的检测波长，在此波长处绿原酸的检测灵敏度最高，故确定327nm为检测波长。再次比较不同比例流动相乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87，45:55，30:70，25:75等)，结果显示乙腈-0.4%磷酸溶液(13:87)时峰的分离度和峰形都为最好。霜降对绿原酸含量的影响：HPLC的结果表明，金银忍冬的叶、枝条和果实中绿原酸的含量均在霜降时下降，而在霜降后7～10d恢复到原有含量，枝条和果实中绿原酸的含量更高。可见霜降对绿原酸的含量有积极的作用，霜降对其含量变化为正向影响，随着霜降的发生，绿原酸在金银忍冬各个部位的含量越高，可根据此特点，调整对其采集利用的时期，提高利用率。