玉米须多糖对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏miR-146a/NOX4/ROS通路的影响

舒 涛，王浩然，李恩丞，金颖新，谷青芸，尤清欣，李子轩，张东东，梁衍锋

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种无过量饮酒史并以肝细胞脂肪变性沉积、胰岛素抵抗、氧化应激等密切相关的临床病理综合征，其患病率在普通人群中达20%～30%，在代谢紊乱特殊群体可达70%[1]。目前，临床上治疗NAFLD主要以保肝、降脂等药物结合饮食、运动等为主，仍缺乏较好的有效药物。氧化应激作为肝脏损伤、炎性反应与纤维化发生发展的重要机制，抑制肝脏氧化应激反应是延缓慢性肝脏疾病发生发展的重要途径。

玉米须多糖是从中药玉米须中提取的有效成分，具有抑制肿瘤、降血糖、利尿、抗氧化等作用。近年来，对其清除自由基、抗氧化作用的研究日益增多。有研究显示[2]，玉米须多糖对1,1-二苯基- 2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率呈明显的量效关系，最大清除率可达68.13%；其对氧自由基和羟基自由基的清除率分别为77.56%和82.31%。体内实验表明[3]，老年大鼠给予玉米须多糖灌胃30d后可明显改善脑、肝和血清中的氧化应激指标，提高抗氧化、抗衰老能力。然而，玉米须多糖的抗氧化应激机制仍不明确。

微小RNA( microRNA, miRNA) 是一种由内源性发夹结构转录产物衍生而来的非编码RNA，由18～24个核苷酸组成，通过与目标 mRNA 的互补序列结合来调控相关基因的表达，影响着细胞增殖、凋亡、炎症、氧化应激和代谢等过程[1]。miR-146a是人细胞内广泛存在的由内源基因编码的长度约22个核苷酸的微小RNA，具有抑制氧化应激和炎症因子表达等生物学作用。有报道显示，miR 146a可通过降低糖尿病肾病模型Nox4表达而抑制氧化应激反应[4]。因此，本实验通过研究玉米须多糖对非酒精性脂肪肝miR-146a/NOX4/ROS信号通路的影响，阐明玉米须多糖对非酒精性脂肪肝的治疗机制，为非酒精性脂肪肝的临床治疗和玉米须多糖的药物开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要实验仪器

全自动生化分析仪(美国康宁公司)；细胞超声波破碎仪(美国Thermo Scientific公司)；XMTD-4000 恒温水浴锅(皓庄仪器有限公司)；PowerPC电泳仪、Trans-Blot转移电泳槽(美国Bio-Rad公司)；高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)；PCR扩增仪-9700(美国应用生物系统公司)；752 型紫外分光光度计(上海光学仪器厂)；酶标仪(美国 Thermo Scientific 公司)；HZS-H 恒温摇床(常州中捷实验仪器制造有限公司)等。

1.1.2 主要实验试剂

Real-time PCR试剂盒(TaKaRa公司)；引物(广州锐博生物科技有限公司)；NOX4抗体(美国Santa Cruz公司)；marker(美国Thermo Scientific公司)； SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)； ROS检测试剂盒(上海心语生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组

雄性SD大鼠40只，体重180～200g，适应性喂养7d，随机分为4组(正常+生理盐水组、正常+玉米须多糖组、NAFLD+生理盐水组、NAFLD+玉米须多糖组)。正常组饲喂正常饮食。NAFLD组饲喂自制高脂饮食(基础饲料80.5%，猪油7%，胆固醇2%，蛋黄粉10%及胆盐0.5%混合而成)，4周后分别进行玉米须多糖提取物或生理盐水强饲，12周后取材。

1.2.2 玉米须多糖提取

玉米须于成熟后采摘于佳木斯市周边地区，除去杂质，烘干至恒重，用粉碎机粉碎备用。采用水溶醇沉的方法，经过大孔树脂脱色后，SEVAGE 法去除蛋白，依次经无水乙醇、95%乙醇、乙醚、丙酮多次洗涤去除杂质，干燥至粉末备用，使用时生理盐水溶解现用现配。

1.2.3 大鼠血清及肝脏生物化学指标检测

大鼠处死前12 h禁食水，称重，10%水合氯醛(0.35mL/100g)麻醉，经腹主动脉采血，分离血清，进行血清生化指标检测，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)。

1.2.4Real-TimePCR检测大鼠肝脏miR-146a的表达

Trizol裂解液提取肝脏总RNA，检测纯度，按照逆转录试剂盒说明书进行Real-Time PCR，用于基因编码扩增的引物序列U6 snRNA(上游引物为：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')、miR-146a(miR-146a 上游引物: 5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3；下游引物: 5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′)；反应条件为： 42 ℃ 逆转录为cDNA， 95℃30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；分析扩增曲线和融解曲线，以U6 snRNA为miR-146a表达的内参，采用2-ΔΔCt方法计算miR-146a的相对表达量。

1.2.5Westernblot检测NAFLD大鼠肝脏NOX4的表达

参照蛋白提取试剂盒提取大鼠肝脏总蛋白。按照凝胶配制试剂盒使用说明制备凝胶，将配好的凝胶按要求注入胶板空隙内，插梳，备用；将预染Marker及各组样品分别依次加入对应的孔道；低温状态下120V电泳，使蛋白完全分离；先裁剪合适大小的PVDF膜甲醇浸泡，滤纸电转液浸湿，将厚滤纸、凝胶、PVDF膜、厚滤纸依次按顺序放置，转膜；5% 脱脂奶粉37℃恒温箱中封闭1h；加入5%脱脂奶粉稀释的一抗在膜上，4℃冰箱过夜；复温1h，TBST洗涤后加入二抗，摇床孵育 1h； TBST 清洗3次，每次10 min；加ECL化学发光成像仪内成像，拍照采集；对采集的图像使用Quantity One软件进行分析。

1.2.6 肝脏ROS水平检测

大鼠取材前12h禁食水，取肝组织，按照试剂盒说明制备10%的肝脏匀浆，测定大鼠肝脏组织ROS含量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 玉米须多糖对NAFLD大鼠血生化指标的影响

与正常组比，NAFLD组大鼠肝脏指数明显增高，血清ALT、AST、TG、TC均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与NAFLD+生理盐水组相比，NAFLD+玉米须多糖组大鼠肝脏指数明显降低，血清ALT、AST、TG、TC均显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 玉米须多糖对NAFLD大鼠血生化指标的影响

2.2 玉米须多糖对NAFLD大鼠肝脏miR-146a表达的影响

与正常组比，NAFLD组大鼠肝脏中 miR-146a mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与NAFLD+生理盐水组相比，NAFLD+玉米须多糖组大鼠肝脏miR-146a mRNA表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 玉米须多糖对NAFLD大鼠肝脏miR-146a及ROS的影响

2.3 玉米须多糖对NAFLD大鼠肝脏NOX4蛋白表达的影响

与正常组比，NAFLD组大鼠肝脏 NOX4蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与NAFLD+生理盐水组相比，NAFLD+玉米须多糖组大鼠肝脏NOX4蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1 。

图1 玉米须多糖对NAFLD大鼠肝脏NOX4蛋白表达的影响

2.4 玉米须多糖对NAFLD大鼠肝脏ROS水平的影响

与正常组比，NAFLD组大鼠肝脏ROS水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)； 与NAFLD+生理盐水组相比，NAFLD+玉米须多糖组大鼠肝脏ROS水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

非酒精性脂肪肝(NAFLD)由于症状比较隐匿，不容易被发现，但其后期可进一步发展为肝纤维化，甚至是肝癌。因此，对于非酒精性脂肪肝的防治具有重要的意义。然而，临床上目前仍缺乏有效安全的防治药物。研究表明，非酒精性脂肪肝的发生发展与肝脏的氧化应激的发生密切相关[5]。玉米须多糖安全无毒，且具有很好的抗氧化作用，但其在非酒精性脂肪肝的防治中的应用尚缺乏理论依据。

我们通过给大鼠饲喂高脂饮食来造成非酒精性脂肪肝模型，发现饲喂12周后，NAFLD组大鼠体重和肝脏指数明显增加，血清ALT、AST、TG、TC均明显增高，说明造模成功；而玉米须多糖干预后在正常大鼠上述指标未见明显异常，在NAFLD组则明显降低，说明玉米须多糖对于NAFLD具有较好的治疗作用，而且对于正常大鼠未见明显影响。研究发现，miR-146a能够明显抑制氧化应激和炎症，可能通过下调NOX4的表达减少ROS的生成[6]。我们的研究结果发现，NAFLD时肝脏miR-146a的表达明显降低，NOX4的表达则明显升高，并使肝脏ROS水平明显增加，从而促进NAFLD肝脏氧化应激的发生。NOX4作为体内ROS的重要合成酶，其主要在肝脏表达，且在肝纤维化治疗中存在着重要意义。研究表明，肝细胞中特异性缺失Nox4可明显减轻饮食引起的肝损伤、肝纤维化和肝胰岛素抵抗[5,7]。ROS作为NOX4合成的效能产物，具有极强的氧化攻击性，其可直接攻击细胞膜、细胞器、DNA以及具有重要功能的蛋白信号因子，造成细胞膜和细胞其膜脂质过氧化，导致肝细胞损伤。以上结果说明长期高脂饮食造成NAFLD可能与miR-146a表达受抑并进一步使肝脏NOX4和ROS水平增高有关。我们在应用玉米须多糖干预后，发现其可明显升高NAFLD时肝脏miR-146a的表达，同时下调NOX4的表达和ROS的水平。提示玉米须多糖可明显抑制NAFLD大鼠肝脏NOX4的表达和ROS的产生，这可能与其能够上调肝脏miR-146a表达有关。

综上所述，玉米须多糖能够明显抑制高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝的发生发展，该作用可能与其对miR-146a/NOX4/ROS通路的调控有关。