HPLC同时测定感冒解毒灵颗粒中8种有效成分的含量

张 娟，杜 武，张秋芳，刘宏明*

（1.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086；2.淄博市中心医院，山东 淄博 255036）

感冒解毒灵颗粒收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第十九册，是纯中药制剂，由紫苏叶、板蓝根、前胡、防风、金银忍冬叶、连翘、麦冬、苦杏仁、羌活、川芎、陈皮、桑白皮、牛蒡子等13味中药构成，功能主治为解表散寒，宣肺止咳，清热解毒[1]。组方中，板蓝根有抗病毒、降血脂和降血糖等药理作用，（R,S）-告依春为代表的生物碱已被证明有明显的抗病毒活性[2]；防风主治外感风寒、周身疼痛等症，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷等色原酮是防风主要的活性成分[3]。现原感冒解毒灵颗粒质量标准无含量测定项目，为了更有效地控制感冒解毒灵颗粒质量，结合中国药典，本文选取了感冒解毒灵颗粒中的6味药材的8种指标性成分作为研究对象，包括板蓝根中的（R,S）-告依春，防风中的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷，金银忍冬叶中的新绿原酸、绿原酸[4]，连翘中的连翘苷，陈皮中的橙皮苷，牛蒡子中的牛蒡苷，建立了高效液相色谱法（HPLC）同时测定感冒解毒灵颗粒中8种成分含量的方法，为进一步完善其质量标准及制剂开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器（美国安捷伦公司）；KS-300E超声波清洗器（宁波科生仪器厂）；十万分之一MS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多）。

1.2 试药

（R,S）-告依春对照品（批号：111753-210706，含量100 %），绿原酸对照品（批号：110753-201817，含量96.8 %），升麻素苷对照品（批号：111522-201712，含量96.2 %），5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（批号：111523-201610，含量96.1 %），橙皮苷对照品（批号：110721-201617，含量96.1 %），连翘苷对照品（批号：110821-201615，含量94.9 %），牛蒡苷对照品（批号110819-201611，含量95.9 %）均购自中国食品药品检定研究院；新绿原酸对照品（ANPEL，批号：E0420010，含量99.0 %）；感冒解毒灵颗粒（批号：181214，180902，181114）均为市购；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SynergiTMHydro-RP 80Ȧ（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %磷酸的水溶液（B），梯度洗脱（0～15 min，5 % A；15～30 min，5 % A ～8 % A ；30～58 min，8 % A～12 % A；58～65 min，12 % A ～18 % A；65～75 min，18 %A～25 % A；75～90 min，25 % A～30 %A；90～100 min，30 % A～50 % A）；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；检测波长：（R,S）-告依春245 nm，新绿原酸和绿原酸327 nm，升麻素苷和5-O-甲氧基维斯阿米醇苷254 nm，橙皮苷283 nm，连翘苷和牛蒡苷278 nm；进样量：10 μl。在此色谱条件下，8种成分理论板数均大于5000，相邻两色谱峰分离良好，见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 取感冒解毒灵颗粒的内容物，研细，取细粉约2 g，精密称定，置入具塞锥形瓶，精密加入甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声提取（功率为300 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2 阴性样品溶液 根据感冒解毒灵颗粒处方，模拟其制备工艺，制备不含板蓝根、防风、金银忍冬叶、连翘、陈皮、牛蒡子的阴性样品，依照2.2.1项下方法制备相应阴性样品溶液。

2.2.3 对照品溶液 精密称取（R,S）-告依春对照品10.97 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为（R,S）-告依春对照品贮备液（0.1097 mg/ml）；同法制成新绿原酸对照品贮备液（0.4035 mg/ml）、绿原酸对照品贮备液（0.9835 mg/ml）、升麻素苷对照品贮备液（1.045 mg/ml）、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品贮备液（0.6400 mg/ml）、连翘苷对照品贮备液（0.9604 mg/ml）、牛蒡苷对照品贮备液（1.100 mg/ml）。精密称取橙皮苷对照品16.99 mg，置入50 ml量瓶，分别精密加入上述7种对照品贮备液0.5，2，2，2，1，5，3 ml，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备溶液[含（R,S）-告依春1.097 μg/ml、新绿原酸16.14 μg/ml、绿原酸39.34 μg/ml、升麻素苷41.79 μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷12.80 μg/ml、橙皮苷326.5 μg/ml、连翘苷96.04 μg/ml、牛蒡苷绿原酸66.00 μg/ml]。精密量取10 ml混合对照品贮备液，置入20 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液[含（R,S）-告依春0.5485 μg/ml、新绿原酸8.070 μg/ml、绿原酸19.67 μg/ml、升麻素苷20.89 μg/ml、5-O-甲基维斯阿米醇苷6.4 μg/ml、橙皮苷163.3 μg/ml、连翘苷48.02 μg/ml、牛蒡苷33 μg/ml]。

2.3 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液的色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，而阴性样品溶液在此保留时间处无干扰。

图1 HPLC色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液1，5，10，15，20 μl及混合对照品贮备液20 μl，按2.1项下色谱条件依次进样，记录8个成分的色谱图及峰面积。以进样量（μg）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。结果表明8个成分在表1范围内线性关系良好。

2.5 定量限和检测限

精密量取混合对照品溶液1 ml，置入50 ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取适量，用甲醇稀释制成不同浓度系列的混合对照品溶液，按2.1项下的色谱条件进行测定，以信噪比（S/N）为10时测定定量限，信噪比（S/N）为3时测定检测限，结果见表1。

2.6 精密度考察

取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。（R,S）-告依春、新绿原酸、绿原酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、连翘苷和牛蒡苷峰面积RSD分别为1.20 %，0.73 %，0.92 %，0.85 %，1.32 %，1.15 %，0.71 %和0.92 %。结果表明，仪器精密度良好。

表1 8种成分线性关系考察结果及定量限、检测限

2.7 重复性考察

取同批号样品（批号：181214），按2.2.1项下方法，制备6份供试品溶液，分别测定（R,S）-告依春、新绿原酸、绿原酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、连翘苷和牛蒡苷含量，结果样品中平均含量分别为0.06243，0.1832，0.3634，0.4292，0.4507，12.21，3.214和1.836 mg/袋，RSD分别为1.37 %，1.03 %，1.14 %，1.16 %，0.81 %，0.62 %，1.45 %和1.18 %。结果表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性考察

取按2.2.1项下方法制备的供试品（批号：181214）溶液，分别于制备后0，4，8，12，18和24 h进样分析，测得（R,S）-告依春、新绿原酸、绿原酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、连翘苷和牛蒡苷峰面积的RSD分别为1.14 %，0.84 %，0.98 %，1.12 %，1.35 %，0.91 %，1.34 %和1.23 %，结果表明，供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率实验

取已知含量的感冒解毒灵颗粒样品（批号：181214）6份，每份约1 g，精密称定，置入具塞锥形瓶中，分别精密加入混合对照品液[（R,S）-告依春、新绿原酸、绿原酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、连翘苷和牛蒡苷8种成分的浓度分别为1.207，3.632，7.868，8.358，8.960，241.0，63.32，385.0 μg/ml]10 ml，再精密加入甲醇10 ml，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，分别测定8种成分含量，计算回收率。结果（R,S）-告依春、新绿原酸、绿原酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、连翘苷和牛蒡苷8种成分的平均回收率分别为99.76 %，99.43 %，99.90 %，97.84 %，99.62 %，99.25 %，98.67 %，98.10 %，RSD分别为1.80 %，1.04 %，1.59 %，1.77 %，1.73 %，0.58 %，1.49 %，1.50 %，结果见表2。

2.10 样品测定

取不同生产厂家感冒解毒灵颗粒，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，样品中（R,S）-告依春、新绿原酸、绿原酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、连翘苷和牛蒡苷的含量测定结果见表3。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

考察了加热回流提取法和超声处理两种提取方法，提取率无显著差别，因此选择操作简便的超声提取法。同时，考察了3个不同提取时间（20，30和40 min）对提取效率的影响，30 min各成分的响应高于20 min，而40 min与30 min对各成分响应影响不大，最终确定了提取时间为30 min[5]。

3.2 波长的选择

感冒解毒灵颗粒成分复杂，单一检测波长会出现色谱峰组成单一、峰面积偏小、特征峰数量少等情况，本文采用DAD 检测器进行全波长扫描（200～400 nm），分析8种成分的紫外光谱，选择了8种成分的最佳检测波长[6-8]。多波长同时检测提高了检测成分的灵敏度，减少了测定误差。下一步开展感冒解毒灵颗粒的指纹图谱研究时可选用共有峰较多的245 nm作为指纹图谱的吸收波长。

3.3 流动相的选择

甲醇-水或乙腈-水[6]条件下的色谱峰拖尾，分离度和峰形较差，以乙腈-0.1 %磷酸为流动相时，峰形尖锐。采用等度洗脱[7-8]很难将8种成分与其他色谱峰完全分开，因此本文建立了一种梯度洗脱方法，色谱峰分离效果好，且8种成分均具有较好的稳定性、精密度和重复性，减少了测定误差。

表2 回收率试验结果（n=6）

表3 样品含量结果/mg·袋-1

综上，本文建立HPLC法同时测定感冒解毒灵颗粒中8种成分的定量分析方法，方法重现性好，专属性强，可为综合评价感冒解毒灵颗粒提供参考。