发酵温度对苹果酵素抗氧化性和安全性的影响

李 红，毛继龙，陈文静，邱忠平，李 萍，彭传海，李明星，汤国雄

（西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都 610031）

酵素是以水果、蔬菜、食用中药材等为原料，通过微生物发酵而成的一类具有保健功能的发酵制品[1]。酵素中不仅含大量氨基酸等发酵原料中的原有成分，也有较高含量的还原糖、维生素C、酚类、花色苷、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化物质[2]，具有抗氧化、清除人体自由基等多种益生作用[3-4]。苹果富含维生素C、酚类、矿物质等多种功效物质，是人体外源性抗氧化物质的重要来源之一[3]。苹果是酵素良好的原料，苹果酵素不仅保留了苹果中原有的有效成分，发酵过程中还会产生多种生物活性物质及功效酶，可降解食物中蛋白质等物质，利于人体吸收，同时还有助于清除人体代谢中凋亡的细胞[5]，具有很高的实用价值。

发酵温度通过影响微生物生长代谢，进而影响酵素中抗氧化物质含量和抗氧化活性，是决定酵素品质的重要因素之一。研究表明，适宜的发酵温度是生产高品质酵素的关键，若发酵温度过低，微生物生长代谢缓慢，SOD及各种产物含量较低；温度过高，高温会抑制微生物中酶的活性，进而抑制微生物的生长代谢，所产生的SOD及各产物量低[6]，也可能会造成发酵不彻底，且易受有害微生物的污染，进而影响酵素的品质[7]。目前对苹果酵素的研究主要包括天然发酵过程中代谢产物、抗氧化活性的变化，短期发酵工艺对苹果酵素抗氧化活性的影响等[8-10]，而关于发酵温度对苹果酵素抗氧化性和安全性的影响研究未见报道。本文以苹果为发酵原料，接种本课题组自主研制的益生菌剂，研究发酵温度对苹果酵素品质的影响，获得较优的发酵温度，以期为苹果酵素工业化生产提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

小金苹果，红糖（什邡市益康食品有限公司），均为市售；益生菌剂为本项目组自行研制，由干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）Q16、哈伯氏乳杆菌（Lactobacillus harbinensis）QH21、屎肠球菌（Enterococcus faecium）QH19、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）QH1、酿酒酵母QH2、酿酒酵母QH18、枯草芽孢杆菌QH10、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）QH12组成，分别按质量比2:20:35:5:15:15:3:5制成的菌剂；SOD检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验设计

1.2.1 苹果酵素的制备 以无菌水冲洗苹果，切丝、阴干备用，发酵体系中苹果:红糖:水的质量比为2:1:1，益生菌剂按0.5 %（m:m）接种，分别置于10，20，25，30，35 ℃培养箱中发酵120 d。发酵原料基本理化性质见表1。

1.2.2 样品采集 发酵结束时取发酵液50 ml，7000 r/min离心5 min，取上清测定。

1.2.3 测定方法 采用紫外分光光度法测定维生素C[11]；福林酚法测定总酚[12]；采用pH试差法测定花色苷[13]；铁氰化钾还原法测定还原力[14]；参考文献[1]测定超氧自由基清除率、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率；采用试剂盒测定SOD；参照（GB/T5009-2016）方法测定甲醇、甲醛[15]；采用酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1[16]；参照GB 4789.3-2016测定大肠菌群数，参照GB 4789.10-2016测定金黄色葡萄球菌数，参照GB 4789.4-2016测定沙门菌[17]。每个试样重复测定3次。

1.3 数据处理

用Excel 2010对实验数据进行基本处理，SPSS 22.0进行主成分相关性分析、模糊数学分析。

2 结果

2.1 苹果酵素的抗氧化性

2.1.1 抗氧化指标 维生素C、总酚、花色苷、SOD等抗氧化物质具有抑制自由基的产生或直接清除清除基、激活抗氧化酶体系等作用[1-2]。检测苹果酵素的维生素C含量、总酚含量、花色苷含量、SOD活性、还原力、羟自由基清除能力、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率，结果见表2。

由表2可见，发酵温度为10～25 ℃时，随着温度升高，维生素C、总酚、花色苷含量增加、SOD活力升高；发酵温度为25 ℃时，维生素C、总酚、花色苷含量、SOD活力达最大值；发酵温度高于25 ℃时，维生素C和总酚含量、SOD活力降低。表明发酵温度为25 ℃时苹果酵素的抗氧化物质含量最高。

表1 发酵原料基本理化性质

表2 5组苹果酵素的抗氧化指标

发酵温度为25 ℃时，超氧自由基清除率、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率均高于其他各组（P＜0.01）；还原力高于其他各组（P＜0.05，P＜0.01），表明发酵温度为25 ℃时，苹果酵素的抗氧化活性相对较高。

2.1.2 主成分分析 对维生素C、总酚、花色苷、SOD 4种抗氧化物质和还原力、羟自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除4种抗氧化活性体系进行主成分相关性分析，利用SPSS 22.0软件计算相关性结果、主成分特征值、方差贡献率和累积贡献率，结果见图1。

图1 主成分分析载荷图

由图1可见，共提取出2个主成分，第一主成分特征值为5.98，方差贡献率达74.7 %，其中影响载荷权数大小依次为SOD活力、DPPH自由基清除率、总酚含量、花色苷含量、羟自由基清除率；第二主成分特征值为1.22，方差贡献率为15.2 %，各指标所占载荷权数较小；2个主成分累计贡献率达89.9 %，其他主成分的贡献率可忽略不计。其中第一主成分中总酚含量与羟自由基清除率位置近，相关性高；第二主成分中花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除位置近，相关性高。表明酵素中花色苷、总酚、SOD具有一定抗氧化活性。

2.1.3 模糊数学分析 通过模糊数学分析法对5组酵素的抗氧化物质含量和抗氧化活性体系的数据进行无因次化处理。采用标准离差法计算权重。模糊转化矩阵R见表3。通过等权和加权法分别对5组酵素的抗氧化性进行比较，5组酵素指标的评分结果见表4。

综合分析结果取等权和加权的和，其中评分越高表示该组抗氧化性越高。由表4可见，5组酵素在不同发酵温度下抗氧化指标评判排序依次为25 ℃＞30 ℃＞20 ℃＞10 ℃＞35 ℃，即在25 ℃发酵条件下苹果酵素的抗氧化性最高。

2.2 有害指标

酵素在发酵过程中会产生甲醇、甲醛等有害物质，且易受致病微生物的污染，严重影响酵素品质。本文以甲醇、甲醛、黄曲霉毒素、大肠杆菌菌群、金黄色葡萄球菌、沙门菌为有害指标，评判酵素的安全性，5组酵素中有害指标结果及比较结果见表5。

表3 模糊转化矩阵R

表4 模糊数学分析法结果及排序

由表5可见，发酵温度为10～35 ℃时，甲醇和甲醛含量随发酵温度升高而增高，表明发酵温度高可促进甲醇和甲醛生成，35 ℃时，酵素中甲醇和甲醛含量最高，但均分别低于0.40 mg/ml和2.00 μg/ml，符合GB2758-2012的要求。各组均未检出黄曲霉毒素及有害微生物（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌），均符合GB2761-2017和GB2758-2012的要求，表明10～35 ℃均为适宜的发酵温度，但为了提高酵素的安全性，10～25 ℃为苹果酵素较适宜的发酵温度。

3 讨论

发酵温度通过影响微生物的活性及抗氧化物质的合成、氧化和分解速度，进而影响抗氧化物质的含量。发酵温度为10～25 ℃时，微生物生长代谢速率随温度升高而加快，促进苹果中维生素C、花色苷等物质的溶出，且微生物在生长代谢时会产生一定量的维生素C、酚类、花色苷等抗氧化物质[3,12]，使体系中抗氧化物质含量逐渐增加，SOD活力增强；发酵温度为10 ℃时，酵素中微生物活性低，抑制了抗氧化物质的溶出或产生，抗氧化物质含量低；发酵温度为25 ℃时，酵素中维生素C、总酚、花色苷含量达最大值，分别为41.70 mg/ml，2.11 mg/ml，61.11 mg/L，SOD活力达267.25 U/L。发酵温度为25～35 ℃时，升高发酵温度虽有利于提高微生物的活性，促进维生素C、酚类等抗氧化物质的溶出或产生，但维生素C、酚类、花色苷等物质易受温度影响，随温度升高其氧化或分解速度加快[12-13]，含量逐渐降低。因此发酵温度为25 ℃时，酵素中抗氧物质产生或分解速度适中，更好地维持体系中抗氧化物含量，使得该组的抗氧化性物质含量最高。

通常将还原力、羟自由基清除率、超氧自由基清除率、DPPH自由基清除率作为酵素的抗氧化活性体系，抗氧化活性高低与抗氧化物质的含量密切相关，但不同的抗氧化物质和抗氧化活性相关程度不同[1]。主成分分析抗氧化物质的含量和抗氧化活性的相关性结果（图1）表明，总酚和羟自由基清除率呈显著正相关，花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05），而维生素C含量与总酚含量、花色苷含量、SOD活力、羟自由基清除率、超氧自由基清除率及DPPH自由基清除率的相关性不大，即总酚、花色苷、SOD活力对酵素体系的抗氧化活性影响较大。本文研究结果显示，发酵温度为25 ℃时，总酚含量、SOD活力、花色苷含量最高，表明该组的抗氧化活性最高。

表5 5组苹果酵素中的有害指标

苹果皮中的果胶质在甲酯酶作用下水解产生甲醇；甘氨酸脱羧生成甲醇；果酸物质受热分解产生甲醇[18-19]。甲醛是酵母菌的一种代谢产物，酵素中甲醛主要来自于甲醇的氧化脱氢，在甲醛脱氢酶的作用下又继续氧化成甲酸，然后在甲酸脱氢酶作用下继续氧化生成二氧化碳[20]。发酵过程中过量甲醇和甲醛的产生易对人体造成伤害[15]。发酵温度主要通过影响甲酯酶、甲醇脱氢酶等多种酶活性，进而影响甲醇和甲醛的含量。10～35 ℃时，随发酵温度升高，甲醇含量逐渐增加，这是由于发酵温度升高使甲酯酶、蛋白酶等多种酶活性增强，继而对果胶等物质分解彻底，产生大量的甲醇，甲醇再进一步转化为甲醛，使甲醛含量增加； 35 ℃时，甲醇和甲醛含量达最高（P＜0.05）。因此，发酵温度越低，酵素中甲醇和甲醛含量越低，但为了提高苹果酵素的品质，建议发酵温度为25 ℃。

4 结论

发酵120 d时苹果酵素中各指标趋于稳定，发酵温度为25 ℃时，酵素中的花色苷含量、羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原力、SOD活力均最高；总酚含量和羟自由基清除率呈显著正相关，花色苷含量、SOD活力、DPPH自由基清除率呈显著正相关（P＜0.05）；5组酵素中有害物质和有害微生物均符合国家相关标准；模糊数学综合评判结果为25 ℃发酵条件下，苹果酵素的抗氧化性最高，品质最优。