转基因作物非预期效应的代谢组学研究进展

刘慧玲，罗小伟，郭佳乐，张可炜

（山东大学 生命科学学院 植物发育与环境适应生物学教育部重点实验室，山东 青岛 266237）

转基因植物是指为了获得原受体植物没有的特定性状，而引入可带来这一特定性状外源基因的植物。转基因是涉及向受体生物的基因组中导入已知可带来预期性状的DNA序列元件的操作，旨在使受体生物细胞中产生特定的基因表达产物，以通过已知的代谢通路实现某一性状，从而赋予受体生物能耐受/抵抗各种生物或非生物胁迫、品质改良等特性。在对某一转基因事件进行确认时，需提供必要的分子生物学证据，如外源基因插入的位点、插入的拷贝数、外源DNA插入的旁翼序列等，以了解是否有内源基因或调控元件受到影响[1]。

利用转化事件培育的作物新品系（种）与传统育种存在明显的不同，在传统育种中，人们在很少或根本不了解作物细胞中遗传变化的情况下利用了一些突变，事实上已经接受了来自野生近缘种的许多未详细描述的基因，即使这些基因可能没有食用安全历史记录，也被导入农作物新品种中以获得新的或改良的农艺性状。与传统育种不同，转基因育种导入作物基因的序列与功能均是明确的，只要目标基因通过了严格安全评价将是安全的。大量的同行评审的出版物和监管机构提交的文件表明上市的转基因作物与传统作物在成分上的“实质等同性”，其安全性与传统作物是同等的[1]。迄今为止，已进行的科学研究尚未发现与利用转基因作物直接相关的安全事故，即便如此，公众还是越来越关注转基因食品的安全性问题，转基因生物一词已成为一个有争议的话题，因为一些公众担心转基因生物给消费者带来益处的同时，可能还伴随着健康和环境方面的潜在风险[2]。

1 实质等同性

依据经济合作与发展组织（OECD）共识文件（OECD，2006）中的概述，对转基因作物食品安全评估的一个主要原则和指导工具是实质等同性（substantial equivalence）。联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）也对这一原则作了进一步的阐述：实质等同性即转基因生物在组成物质的化学成分上与相对应的受体生物不存在实质性的差异，则可认为该转基因生物是安全的。在安全评估中，对来自转基因作物的食品与来自亲本或近同基因系的同类食品进行比较，以确定二者之间有无差异后评估基因工程食品对人类和/或动物安全与否。对于转基因作物进行评估可以考虑3种情况，对于不同的情况不同对待。第一种情况是新类型的食品等同于公认的传统食品，在这种情况下，无需进行进一步的测试。第二种情况是新类型的食物与传统的食物相比，仅仅存在新导入的基因带来的某一个特殊性状的差异，不存在其他差异，对新类型食品的安全评估将仅需针对这一差异进行。第三种情况是新类型的食品在诸多方面与传统食品都不同，或没有传统食品与之相对比，对于这种类型的工程食品则需进行更为广泛的、详尽的评价。利用实质等同性原则对比评估已有的结果表明，转基因作物与传统作物之间具有相当的实质等同性，除引入与新预期性状相关的预期效应外，转基因对原有作物特性几乎没有明显影响，过去的这种对转基因植物安全性的评估原则已保证了超过了二十年的转基因产品商业化没有出现问题[3]。

对转基因作物进行安全评价时，人们可能还会对另一个问题特别关心：即通过转基因方法获得改良一个植物品种（系）的某种新的性状时，是否会产生目标性状外的意想不到的效果？如果发生了预料之外的情况，“这种意想不到的效果”是否会对健康产生影响？产生的影响将是什么状况？其实这就是转基因（遗传操作）会不会产生非预期效应的问题。

2 非预期效应

目前，世界对粮食的需求与生产能力之间的差距越来越大。植物生物技术可能是一种有希望提高作物产量的方法，即在不利的环境条件下提高作物的产量与品质，以增强农产品供应能力。目前，人们已利用转基因技术获得了作物的营养品质得到改良及强化、抗虫、耐除草剂等不同类别的转基因新类型作物。植物为了获取这些“额外”的性能，需要对其进行遗传操作。在植物进行遗传（基因工程）操作时，对植物由于目标基因的导入可能对受体生物产生的结果可分为预期效应（intended effects）和非预期效应（unintended effects）。

预期效应是指为了获取某种目标性状而向受体生物导入某个基因后产生了导入基因的目标效果。也就是人们将有利于植物自身更好适应环境（如应对非生物逆境或生物逆境）或满足人类需求（如改进或强化产品的品质等）的特定基因导入受体细胞的基因组中，并能在受体植物中发挥这些基因的功能即获得稳定高效的表达，从而赋予工程植物预期的目标性状。非预期效应是指通过向宿主生物体导入明确的外源基因后，除实现该基因赋予的特定目标性状的同时，还获得了额外性状或失去现有某一性状的效应。也就是与亲本相比，转基因植物在表型、细胞中的化学组分等与亲本相比在统计学上有显着差异。非预期效应又可分为可预期的非预期效应（predictable unintended effects）和不可预期的非预期效应（unpredictable unintended effects）。可预期的非预期效应是转基因生物除产生了目标基因应当产生的结果外，还产生了依据目前植物生理学、代谢途径及代谢的相互关系等诸方面知识可解释的预料之外的变化。不可预期的非预期效应是指在转基因植株中发生了超过当前我们认知水平的不可预料的改变。“黄金水稻”（golden rice）是工程植物的一个成功典范，是Ye等[4]将β-胡萝卜素生物合成途径的相关基因引入到水稻细胞中而获得的。在黄金水稻中产生了β-胡萝卜素是导入的3个目标相关基因的预期结果。在工程植物中偶尔也会出现与基因功能预期不符合的结果。S-芳樟醇合酶（S-linalool synthase）基因在矮牵牛中的过表达并没有导致游离芳樟醇的预期积累，而是表现为S-芳樟基-β-D-葡萄糖苷（S-linalyl-β-D-glucoside）的积累[5]。

非预期效应并非为转基因育种所特有，种内、种间与野生近缘种的杂交、组织培养再生植株和诱变育种（如化学诱变、辐射诱变）等技术手段在传统育种中被广泛使用。研究表明，利用这些技术获得新育种材料通常与基因突变、缺失、插入和重排等有关[6-7]。在农业上，利用杂交、诱变、群体选育等技术进行的常规育种时也会产生非预期效应[1]。虽然育种家选择并有目的地利用植物DNA突变产生的有益表型，但现代的分子技术已使人们能了解常规育种手段获得的作物新品种所包含基因的具体变化类型，这些基因变化似乎是多样和广泛的。但是，人们常常能接受这些基因的改变而很少去担忧这些基因突变出现的安全问题，与此对应的是人们更为关心工程植物可能存在的非预期效应的问题。转基因事件中是否会发生，或者在什么情况下产生非预期效应一直是公众所关心的问题之一，如何有效地检测和评价转基因事件中的非预期效应也成为转基因安全评价的一个重要课题。

3 非预期效应产生的原因

在对植物进行遗传操作的过程中，不同的实验室利用了不同的策略（农杆菌介导法、花粉管导入法、基因枪法等）将外源目标基因导入不同的植物中。无论采用何种转化策略，由于外源目标基因整合到受体细胞的基因组是一复杂的过程，虽然对目标基因可能带来的目标效果有一个良好的预期，但对于外源基因插入基因组的位置往往预期性不高，外源基因有可能插入到结构基因、启动子或调控区的内部，对结构基因的表达产生一定水平的干扰，造成某些非目标基因表达发生了或多或少的变化，甚至发生了基因沉默现象。受体植物受此影响可能会产生一些在设计获取目标工程植物时无法预期和控制的性状改变。研究表明，对于受体由于插入外源基因，受体可能通过转化效应、插入效应、诱导效应、异质效应等机制影响内源基因的表达而产生非预期效应[8-9]。

4 非预期效应的评估

在转基因植物出现之前，传统育种获得的新作物品种在推向生产之前需通过政府主管部门的审定（认定），但在引入市场之前一般并不要求进行严格的食品安全评价。转基因作物进行商业化推向市场前，建立严格的安全评估程序并对其安全性进行评估被认为是极其必要的，以减轻人们对使用生物技术可能导致新的和不可预料危险的担忧。目前转基因植物的安全性评估多是基于“实质等同”原则，即将转基因植物与亲本或同类植物进行相关特性的比较，以确定二者之间是否存在差异。选定某些成分和特性进行测量或评价，如果转基因植物的成分和特性与常规对照物（如受体植物）的成分和特性没有显著差异，那么转基因植物与对照的成分和特性就被判定为基本相同，也就是认为转基因植物与对照是实质等同。当实质等同的测试得到满足时，就认为转基因植物至少与比较物（对照）具有一样安全性和营养特性。比较物（对照）往往是转基因植物的受体，其往往是一种有多年安全使用历史的人类食物或家畜饲料等的重要来源。对于实质等同原则，Millstone等[10]认为这种评价是存在缺陷、不全面的，因为它没有考虑遗传操作可能带来的非预期效应。目前上市或在研的转基因植物可分为两大类别，类别1通常是通过插入单个基因以赋予昆虫（如棉铃虫）抗性或除草剂（如草甘膦抗性）耐受性的基因工程植物，基因工程植物获得某一特殊农艺特性（如抗虫、除草剂抗性），这类转基因作物如耐除草剂（抗草甘膦等）大豆、抗虫（抗棉铃虫等）棉在世界许多地方广泛种植；类别2为使用了更为复杂代谢工程策略的工程植物，以赋予植物特殊营养功能，给人类带来更多健康益处（如“黄金水稻”）或赋予植物更高的抗逆性（如耐盐耐旱等），这种类型的转基因植物目前被监管部门批准上市的种类较少。对于类型1的转基因植物，出现非预期效应出现的概率可能要小一些，而对于第二类工程植物，非预期效应出现的概率可能要大一些，因为获得这些工程植物往往涉及引入不止一个基因产物的更为复杂的代谢过程，基于此，对类型2的工程植物进行安全评估时或应更严格。

目前评估转基因植物安全性的工具除传统的多点和多年农艺学评估、成分分析、动物营养和经典毒理学评估方法外，“组学”工具在转基因作物的安全性评估方面具有重要应用价值[11]。蛋白质组学、基因组学、转录组学和代谢组学等组学技术是研究转基因植物非预期效应的候选项，“组学”研究策略减少了转基因生物安全性评估中的不确定性，提供了细胞代谢更为深入的信息[12]。

5 代谢组学研究方法

代谢组学的特点是可快速准确地分析代谢物的种类与含量，因而有望提供细胞代谢产物（如小分子量的有机化合物）的全面视图，这些细胞代谢物参与了细胞不同的代谢事件，从中可窥探细胞的生理状态。代谢组学技术应用于转基因植物的安全性评估有助于解析目标基因的功能，了解目标基因如何影响工程植物细胞中代谢途径，阐述目标基因对细胞代谢通路不同层次的影响。

Fiehn等[13]定义代谢组学（metabolomics）是对生物体的所有代谢物进行鉴定和定量分析的学科。代谢组学分为靶向代谢组学（targeted metabolomics）和非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）。非靶向代谢组学是利用代谢物指纹图谱分析技术，对生物样品整个代谢组的成分尽量进行全面的分析。靶向代谢组学是利用相关标准品为对照物，对细胞中特定代谢物组的成分进行检测与分析的技术。关键化合物的靶向分析已广泛用于转基因作物的实质等同研究，并为此建立了相关数据库（如ILSI数据库，http://www.cropcomposition.org）。这些数据库中包含了一些主要常规育种作物的化学成分较为详细的信息，可作为评估转基因作物化学成分组成的基准参照。也有学者建议使用非靶向代谢组学等分析技术来拓宽植物可检测化合物的范围，从而补充当前的靶向代谢组学方法中存在的不足。

依据研究对象和目的，在代谢组学的研究中主要可采取3种策略：（i）靶向分析，有限数量的已知代谢物浓度的精确和定量测定；（ii）代谢谱分析，针对包括未知代谢产物的大量代谢物含量的非靶向高通量测定；（iii）代谢指纹图谱，组别的区分不需要进行代谢物的识别，而是利用快速、全面的生化指纹图谱进行评估[14]。代谢组学分析包含了样品的收集与处理、检测数据的获取和数据解析等过程。气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、超高效液相色谱（UPLC）、毛细管电泳（CE）、傅立叶变换离子回旋共振（FT-ICR）和高场非对称波形离子迁移谱（FAIMS）等分离技术可用于化合物的分离，质谱（MS）、核磁共振（NMR）、电化学（EC）、近红外光谱（NIR）等检测技术常用于化合物的检测鉴定。不同分离技术与不同的检测及鉴定技术相组合就构成了各具特色的不同代谢组学分析技术策略，以满足转基因植物进行风险评估的需求。将色谱高效分离能力和MS的强大鉴定能力相结合将能胜任对工程植物的代谢物进行较为全面的定量或定性研究的需求，如GC-MS、LC-MS、CE-MS、MALDI-MS、SFC/MS、DI-MS等[12,14]。基于色谱和MS技术建立的技术平台如GC-MS平台广泛用于非靶向的分析，而LC-MS平台被广泛用于靶向和非靶向分析。利用这些高通量工具产生的海量数据可通过如MET-COFEA、Met-Align、ChromaTOF、MET-XAlign等数据处理平台进行处理[12]。代谢组学数据在公共数据库中的存储也是需要考虑的重要问题，通过这些数据库可与不同实验室的研究人员共享数据，并有助于不同学者对原始数据进行进一步的利用和解析有用的信息。代谢组学数据库如METLIN（http://metlin.scripps.edu）、GOLM（http://gmd.mpimp-golm.mpg.de）、MoNA（http://mona.fiehnlab.ucdavis.edu）、GMD（http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/）等可用于代谢物的鉴定与数据参考[15]。此外，GNPS（Global Natural Products Social Molecular Networking）数据库（http://gnps.ucsd.edu）允许上传和共享未识别的光谱，从而能通过MS匹配识别新的代谢物[16]。

6 代谢组学在非预期效应研究中的应用

Simó等[17]综述了2014年前10年间发表的关于转基因作物代谢组学研究的59篇相关文献。在这篇综述中，作者提供了代谢组学在转基因植物中的研究状况相关信息。文献报道的代谢组研究涉及水稻、玉米、大豆、紫花苜蓿、豌豆、小麦、西红柿、土豆、莴苣、黄瓜、覆盆子、葡萄、薄荷、卷心菜、木瓜、杨树、大麦等作物，以及抗虫、抗除草剂、品质改良、微生物抗性、生长发育、耐旱等生物学性状，利用NMR、GC-EI-Q-MS、LC-ESIQ-MS、CE-ESI-IT-MS/MS等分析技术进行了代谢组学研究。与传统分析方法相比，代谢组学方法可获得更多、更深入的转基因作物的化学组分相关信息，提供了更为广泛的化学成分组成数据，这些数据有助于证实（或不证实）转基因植物的实质等同性和由于遗传转化而引起的非预期效应的发生。

在非预期效应的评估方面，Shepherd等[18]利用代谢组学，采用LC-MS和GC-MS方法对糖苷生物碱（glycoalkaloid）生物合成中涉及的3个基因（SGT1、SGT2或SGT3）分别下调的转基因马铃薯进行了评估，以了解这些特定修饰导致的预期和非预期的代谢变化。结果表明，在SGT2或SGT3基因下调表达的转基因马铃薯株系细胞中的糖苷生物碱（glycoalkaloid）如预期那样含量下降，但岩藻甾醇（fucosterol）和β-谷甾醇（β-sitosterol）的含量却增加了，而其他代谢物未发现有差异。作者认为在组织培养过程中诱导发生的体细胞无性系变异被认为可能是与发生了的非预期代谢物变化有关。Chris等[19]报道在表达除草剂抗性基因Bar的转基因作物中也发现了非预期效应，发现在转Bar基因的作物中将细胞中的氨基己二酸和色氨酸转化为乙酰-氨基己二酸（acetyl-aminoadipate）和乙酰-色氨酸（acetyl-tryptophan）。虽然工程植物中乙酰-氨基己二酸和乙酰-色氨酸的含量被美国食品和药物管理局（FDA）评估为对人体和动物的食用水平来讲是安全的，但转Bar工程植物发生的非预期效应的案例也应给人们一个警示，在商业化工程作物时还是有必要关注非预期效应的。

作物对盐、旱、虫害等胁迫的抗性、经济产量的高低和农产品品质的好坏等性状大多是由多基因协同控制的复杂性状。传统育种学家可利用杂交、回交等手段，通过聚合基因来培育出品质、抗逆性和经济产量性状优良的作物新品种，以满足种植多样性的需求。转基因作物的基因叠加（gene stacking）的研究与应用也已成为培育具有复杂性状工程作物的技术手段，全球有14个国家/地区在2016年度种植了基因叠加的生物技术作物。基因叠加型转基因作物的迅速应用，使人们开始关注这类产品的安全性与单一性状产品的安全性是否存在不同。无疑，组学研究技术为解决这一问题提供了一个方法选择。Wang等[20]利用转录组学和代谢组学的技术手段解析了杂交种12-5×IE034、来源亲本（转基因自交系12-5和IE034）及郑单58等6个常规玉米自交系间的基因表达和代谢产物异同。转录组和代谢组的结果表明，供测试的玉米品种间在基因表达和代谢产物上存在明显差异。12-5×IE034与亲本（12-5和IE034）在基因表达和代谢产物上的差异小于与其他玉米间的差异。这些结果提示，通过育种叠加两个转基因事件不会比传统育种过程引入更大的变异。因此，基因叠加的转基因植株的安全性评估可在单性状亲本安全性评估的基础上采用简化的评价方法。

如何判断遗传修饰植物产生的非预期效应是来源于工程植物的遗传修饰，还是由于环境因素和/或自然变异所导致，代谢组学的研究结果在非预期效应的判断上也提供了一些有益的信息。比较转基因作物及其野生型亲本间的代谢组学研究常与来自更多地理位置（多点）、多年、不同生长季节的不同栽培条件相结合，以调查植物代谢组的变异特性。一些研究结果表明，与基因修饰相比，环境变化通常会产生更大的代谢物组分的差异[21-22]。Barros等[21]以转Bt基因品种DKC78-15B、草甘膦抗性品种DKC 78-35R和非转基因品种CRN 3505（孟山都的玉米品种，DKC78-15B和DKC78-35R的亲本）为材料，采用代谢组学、蛋白质组学和转录组学技术研究了环境条件（不同年份、农业生产方式和地理位置）对转基因玉米的影响。组学的结果表明，环境对玉米样品的基因表达、蛋白质和代谢物的影响大于不同基因型间的差异，环境是主导表达差异的源泉，环境影响比基因插入更为重要。两项针对转基因小麦和大麦品种的非靶向代谢组学研究结果提示，基因操作对作物代谢组的影响要比其他因素（如生长条件、常规品种之间的遗传差异）引起的影响要小[22-23]。Frank等[24]和Harrigan等[25]两个课题组依据对遗传修饰玉米的代谢组学研究结果，也提出环境对作物的影响远远大于基因插入对作物的影响的类似观点。因此，非靶向代谢组学技术将为今后在转基因生物的安全性评价中探讨非预期效应与遗传修饰和环境间的关系提供更好的技术支撑。

有关转基因作物的相关法规政策在不同国家/地区有很大的不同，欧洲食品安全局（EFSA）、OECD等国际组织已提供了对转基因食品进行风险评估的一般性的指南和建议。在转基因食品风险评估实践中，有些学者对目前旨在检测可能由育种过程或基因工程导致的非预期效应的评估方法提出一些质疑，担忧基于有限的代谢产物成分进行的实质等同性评估可能不足以保证新生物技术农作物的安全性，并提出了改进的方法，认为非靶向代谢组学可作为评估未来转基因作物风险评估的常规方法[16]，但也有学者对此提出了不同的看法，他们并不认为非靶向代谢组学能改善转基因作物的风险评估[26]。代谢组学可作为一种颇为有效的检测、分析手段，无疑可帮助人们证明转基因植物是否发生非预期效应，或者，如果它们确实发生了，也可帮助人们了解转基因植物发生非预期效应的可能原因与机制。此外，随着非靶向代谢组学研究技术手段的进一步发展，代谢组学也能为利用基因编辑技术培育的植物新品种（系）的安全性评价提供技术支撑，并期望该技术应用于代谢工程生物技术作物的监管评估[27]，这也将有利于基因编辑作物的推广应用。