(枣庄市食品药品检验检测中心,山东 枣庄 277102)
石榴(Punica granatumL.)为石榴科多年生落叶灌木或乔木植物,别名“安石榴”,全国范围内都有栽培,以江苏、湖南、山东、四川、河北、云南、陕西、新疆等地产量较大,为主产区。石榴的皮、籽、花、叶、根等均有可入药的记载,功效众多,可治下痢漏精、口干、腹痛等,并可驱虫,消肿。石榴籽约占石榴总重的12 %,但由于药用部位主要是石榴皮,因此对石榴籽的利用价值认识还不充分,石榴籽资源潜力未得到相应挖掘。本文对石榴籽的化学成分和药理作用的研究进展进行综述,以期为石榴籽资源的合理开发和综合利用提供参考。
各国学者采用超临界CO2提取、石油醚溶剂提取、索氏提取、冷榨、微波辅助提取、低温连续相变萃取等不同提取方法,结合色谱分析鉴定技术,从石榴籽中分离鉴定出石榴酸、亚麻酸、亚油酸、共轭亚油酸、油酸、花生酸、花生烯酸、11-花生烯酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、十六酸、十七碳酸、十八碳烯-11-酸、二十碳烯酸、二十碳酸-11-酸、二十二碳酸等饱和、不饱和脂肪酸类成分;3-苯基2-丙烯醛、2, 4-壬二烯醛、2, 4-癸二烯醛等烯醛类成分;双氢藁本内酯、亚油酸甲酯、十八烯酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、α-亚麻酸乙酯、γ-亚麻酸乙酯、油酸乙酯、十六酸乙酯等酯类成分;菠菜烯、维生素E和两个未鉴定的石榴酸三烯异构体[1-4]。研究表明,不同提取方法,分析得到的脂肪酸类成分种类和相对含量均有较大差异。分别以乙醇、超临界CO2提取石榴籽油,通过响应面法优化液固比、压力、粉碎度、提取温度和提取时间等主要影响参数,与传统加热回流提取法相比,提取时间缩短,提取率提高,石榴籽油的品质明显优于传统提取[5-6]。以丁烷为介质,通过响应面法优化石榴籽油的亚临界提取工艺,得油率21.07 %[7]。李艳等[8]通过柱前衍生化,以ω-溴代苯乙酮为衍生化试剂,三乙醇胺为相转移催化剂,使得无紫外吸收的石榴酸带上发色团,从而建立了石榴籽油中指标性成分石榴酸的柱前衍生化高效液相色谱(HPLC)定量分析方法。
采用水蒸气蒸馏提取,经气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析鉴定技术,在石榴籽挥发油中检测出35个成分,鉴定出正己醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、13-烯-11-炔-1-十四醇等醇类成分;(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、癸醛、(E,E)-2, 4-壬二烯醛、(E,E)-2, 4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-十一碳烯醛等烯醛类成分;2, 3, 4-三甲基庚烷、十四碳烷、2, 4-二甲基十一碳烷、十七碳烷、二十碳烷、二十二碳烷、2, 6-二甲基二十碳烷、二十九碳烷等烷基化合物和2, 6-二甲基-4-庚酮、2-正丁基呋喃、1-甲基-2-乙基环戊烯等22个化合物,相对含量占样品总量的90.95 %[9]。
对石榴籽中黄酮类成分的研究多集中在提取方法的优选方面。赵国建等[10]以六偏磷酸钠为螯合剂,辅助乙醇从石榴籽中提取黄酮,通过对提取温度、乙醇体积分数、料液比、六偏磷酸钠添加量的正交试验,研究优选石榴籽黄酮的最佳提取工艺,黄酮提取率达0.881 %(m/m)。郭永谊等[11]以芦丁为对照品,采用水提法,比较甜石榴和酸石榴不同部位总黄酮含量,结果表明,各部位中总黄酮的含量,酸石榴均明显高于甜石榴;不同部位总黄酮含量大小顺序为石榴皮>内种皮革质>隔膜>石榴籽。杨肖等[12]采用直接显色法比较石榴皮、籽、花3个部位的总黄酮含量和抗氧化能力,结果表明,不同部位总黄酮含量顺序为石榴皮>石榴花>石榴籽。王占一等[13]研究微波辅助离子液体提取发酵石榴籽总黄酮的的工艺,选择离子液体浓度、提取时间、微波功率为主要影响因素,再通过比色法测定总黄酮对亚硝酸盐的清除能力和亚硝胺合成的抑制能力。结果表明,在最佳参数条件下,总黄酮平均得率为1.65 %;总黄酮对亚硝酸盐的最大清除率为84.4 %;对亚硝胺合成的最大阻断率为76.8 %。常占瑛等[14]采用单因素考察和正交实验设计相结合,以多酚含量为指标,综合直观分析和方差分析,优选新疆石榴籽中总多酚的最佳提取工艺为:乙醇浓度60 %,乙醇量为石榴籽粉末量的12倍,提取温度100 ℃,回流提取1次,提取时间1 h。结果表明,各因素对多酚提取得率的影响顺序为提取温度>乙醇浓度>溶媒量。
王占一等[15]研究复合酶法提取石榴籽多糖,在单因素试验的基础上,通过D-最优混料试验设计优化复合酶的配比,Box-Behnken试验设计优化最佳工艺条件:复合酶最优配比为纤维素酶67.2 %、果胶酶24.2 %、甘露聚糖酶8.6 %;复合酶法提取石榴籽多糖的最佳工艺条件为酶解温度48.5 ℃、液固比20:1(ml/g)、介质pH 4.5、酶解时间287 min,在此条件下,石榴籽多糖得率为2.83 %,该提取方法能指导工业化生产。
采用HPLC建立石榴籽中没食籽酸成分和鞣花酸成分的含量测定方法,经方法学考察,确定色谱条件为:色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶,流速1 ml/min,柱温30 ℃,进样量10 μl,没食籽酸的流动相为乙腈-0.5 %冰醋酸溶液(1:99),检测波长275 nm,鞣花酸的流动相为乙腈-0.2 %磷酸溶液(21:79),检测波长254 nm,并根据测定结果暂定石榴籽中含没食籽酸干品不得低于11.8 mg/g,鲜品不得低于155.0 mg/g,鞣花酸不低于0.07 %的质量限度标准[16-17]。
动物实验和细胞实验表明,石榴籽提取物可预防性保护由四氯化碳诱导的急性肝损伤,能显著抑制急性肝损伤小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)浓度升高,并降低肝组织内丙二醛(MDA)含量,提高肝组织内超氧化物歧化酶(SOD)活性, 对急性肝损伤小鼠肝组织形态学有显著影响,可使小鼠肝细胞变性和坏死程度显著减轻,减少肝脏炎症浸润,并可明显减少L-02细胞凋亡[18]。
动物实验证明:石榴籽水提物能较明显地降低糖尿病小鼠模型的血糖值,改善糖尿病小鼠消瘦和“三多一少”症状,其中以高剂量组的效果最显著[19]。
体外实验表明:石榴籽提取物对·OH和·O2-有很强的清除作用,与维生素C抗氧化作用相似,是一种天然有效的抗氧化剂[20]。过氧化值(POV)是反映油脂氧化程度的一个指标,在体外抗氧化试验中发现,添加石榴籽油的油脂与未添加石榴籽油的空白组相比,过氧化值(POV)均明显偏低,表明石榴籽油对植物油如花生油、色拉油,动物油如猪油均有较好的抗氧化作用,作用优于维生素E[21]。体内实验表明,石榴籽油能明显拮抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠体重减轻,降低肝、肾、脑和血清中 MDA 含量,提高抗氧化酶 SOD 的活性,有效减轻小鼠体内的氧化应激反应且作用与剂量成正相关[22]。
通过卵巢切除制作骨质疏松症模型,研究石榴籽油对去卵巢大鼠骨质代谢、骨关节炎大鼠、小鼠软骨代谢和对雌激素相关的骨质疏松症小鼠股骨近端骨密度和骨小梁微结构的影响。结果表明,补充石榴籽油可有效降低去卵巢大鼠骨质转化活性,抑制骨密度降低,而这种作用可能与石榴籽油雌激素作用和抗氧化作用有关。石榴籽油通过调节相关基因抑制破骨细胞活性,减轻骨吸收和破坏,从而抑制骨质疏松症小鼠骨量丢失;同时通过作用于成骨细胞相关基因,促进成骨细胞分化,促进成骨。石榴籽油代谢物(CLA9C)可抑制RANKL诱导破骨细胞分化,通过增加碱性磷酸酶(ALP)活性和基质矿化促进成骨;同时,主要的转录水平呈现上调。石榴子油抑制雌激素相关的骨质疏松症骨量丢失的同时,还能促进成骨细胞分化,抑制破骨细胞活性,并可改善关节的软骨退变,减少硬性增生,促进软骨恢复弹性,对软骨表现出明显的保护作用[23-26]。
实时荧光定量法研究表明:石榴籽油能以浓度依赖性方式抑制人前列腺癌PC-3细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡;可调控肿瘤细胞周期,阻滞肿瘤细胞于G1期,并抑制细胞进入S期,从而抑制细胞增殖;通过下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax和p53蛋白表达,进而引起细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖[27]。细胞实验表明:通过MTT 法观察细胞增殖活性发现,石榴籽油可抑制MCF-7、MDA-MB-231两种乳腺癌细胞系增殖;通过流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western印迹法检测细胞内相关增殖和凋亡蛋白表达,发现石榴籽油可显著下调乳腺癌细胞中Cox-2、Bcl-2 的表达水平,上调Bax的表达水平、调节胱天蛋白酶(caspase)-3的表达水平,上调MCF-7 中P53的表达水平或下调P53在MDAMB-231 中的表达水平。石榴籽油抑制乳腺癌细胞增殖活性,促进其凋亡作用可能是通过调节细胞中Cox-2、Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶-3及p53 的表达实现的[28]。
石榴籽油能显著改善D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型脾脏/胸腺指数减少,提高衰老小鼠巨噬细胞吞噬能力和表达分泌免疫调节因子的能力,提高血清中免疫球蛋白与补体蛋白的含量,明显改善小鼠免疫功能且呈剂量依赖性关系[29]。
小鼠的子宫增重、游泳和增强免疫力实验表明:不同剂量的石榴籽油均能促进未成熟雌性小鼠子宫发育,延长游泳时间,而脾脏、胸腺的质量未增加。提示石榴籽油有雌性激素样作用和抗疲劳作用[30]。
雄性小鼠的悬尾和强迫游泳绝望抑郁模型实验表明:石榴籽油能减少小鼠悬尾不动和游泳不动的时间,对行为绝望模型小鼠有抗抑郁效果,并呈现一定的剂量正相关[31]。
3.1 石榴籽为维吾尔族和藏族传统用药,收载于《中华人民共和国药品标准-维吾尔药分册》[32]和《卫生部药品标准·藏药第一分册》[33],近年,关于其化学成分的研究主要集中在脂肪酸、挥发油、黄酮、多糖和有机酸类成分,随着气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术的应用,对石榴籽油的研究报道较多,其他成分的研究还有待于进一步加强。
3.2 石榴籽的药理研究主要集中在抗肿瘤、抗氧化、保肝、降血糖、抗疲劳、抗骨质疏松和雌激素样作用,与其保健功能的开发利用密切相关。作为传统的维吾尔族和藏族用药,石榴籽主要用于治疗胃病,但是关于石榴籽对消化系统的药理作用,却鲜有报道,提示这方面的研究有待于加强。
3.3 石榴籽的药理研究多采用石榴籽油和石榴籽醇提物、石榴籽水提物为研究对象,关于石榴籽中化学成分与其药理作用的相关性研究少有报道,提示这方面的研究值得深入。
3.4 我国石榴栽培历史悠久,分布面积广,产量高,各地的特色品种呈现多样化趋势,不同产地不同品种来源的石榴籽资源研究亦值得深入探讨。