快速筛查膏霜类化妆品中41种非法添加糖皮质激素

（南通市食品药品监督检验中心，江苏 南通 226006）

糖皮质激素是一类母核为环戊烷骈多氢菲结构的甾体激素，具有抗炎、抗过敏、抗休克和免疫抑制等药理作用，是临床皮肤科领域应用最广泛的外用药物之一[1]。但长期使用糖皮质激素会产生激素依赖症及其他副作用，甚至引发癌症，对人体造成严重伤害。我国的《化妆品安全技术规范》（2015版）和欧盟化妆品法规中均明确规定化妆品中不得添加任何激素类药物[2]。但因糖皮质激素对皮肤具有显著的消炎祛痘、美白护肤功效，部分商家依然将其非法添加到化妆品中，以谋取不当利益[3]。消费者长期使用这类化妆品，其中激素类药物会通过皮肤吸收进入人体，对消费者的身体健康造成严重影响[3-4]。

近年检测化妆品中糖皮质激素的方法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和液相色谱-高分辨质谱法。质谱法具有选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强等特点，目前已成为最主要的检测手段[5]。与串联质谱相比，高分辨质谱具有更强的定性能力和更高的灵敏度，但仪器成本高、普及率低。因此，对于大多数检测机构而言，液相色谱-串联质谱法更为适用。此外，已报道的方法大多采用固相萃取净化样品，方法耗时，成本高，且难以实现大批量样品的同时处理[6-8]。本研究通过优化样品前处理方法和色谱-质谱条件，建立了液相色谱-质谱同时快速测定膏霜类化妆品中41种糖皮质激素的分析方法。该方法可为化妆品中糖皮质激素的高通量分析提供技术支持，能极大地提高化妆品安全风险的监控水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Vanquish-F高效液相色谱仪（美国Thermo Scientific公司）；TSQALTIS质谱仪（美国Thermo Scientific公司）；BSA224S电子天平（德国Sartorius公司）；MIKRO 220R离心机（德国Hettich公司）；HN22-500A超声波提取器（上海汗诺仪器有限公司）；Xcelvap氮吹浓缩仪（美国Horizon公司）。

1.2 试药

曲安西龙（批号：FS1607684），40种糖皮质激素混标（批号：S018441，美国 A Chemtek Inc公司）；甲醇，乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；乙酸（色谱纯，美国Sigma公司）；其余试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。30批次膏霜类化妆品购自本市各美容院和小商品批发市场。

2 方法

2.1 色谱条件

Thermo Hypersil GOLD 色谱柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm），流动相：0.1 %乙酸水溶液（A）-0.1 %乙酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，68 %A；6～20 min，68 %A～25% A；20～22 min，25 %A；22～22.1 min，25 %～68 %A；22.1～25 min，68 %A），流速：0.3 ml/min，柱温25 ℃，进样量：2 μl。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子扫描；电压3500 V；离子源温度320 ℃；脱溶剂气温度400 ℃；鞘气压力35 Arb；辅助气压力5 Arb；采集方式为多反应监测（MRM），相关质谱参数见表1。

表1 MRM参数

2.3 标准溶液的配制

精密称取对照品曲安西龙2 mg，置入20 ml棕色量瓶，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制成100 μg/ml储备液。分别移取100 μl曲安西龙储备液及40种糖皮质混标（100 μg/ml），置入10 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，稀释成浓度为1 μg/ml的混合对照品溶液。

2.4 样品前处理

称取1 g样品，置入50 ml离心管，分别加入5 ml饱和氯化钠溶液和5 ml正己烷，于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入10 ml乙腈，充分涡旋2 min，超声20 min，4 ℃下以10 000 r/min离心5 min，用针抽取中间层澄清液，转移至氮吹管中，40 ℃下氮吹至近干，用1 ml乙腈溶解，涡旋1 min，过0.22 μm微孔滤膜，上机测定。

3 结果与讨论

3.1 样品的提取

膏霜类化妆品基质较为复杂，需选择合适的提取溶剂。本实验选择丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂，系统地比较了这几种提取溶剂的提取效率。经比较，丙酮对膏霜类化妆品中常用基质如油脂类、蜡类及组成这些成分的高级脂肪酸、高级醇类物质有很强的溶解能力[9]，因此，采用丙酮提取化妆品中糖皮质类激素，将会在提取液中带入过多的杂质，对色谱柱及仪器造成损害；以甲醇为提取溶剂时，甲醇和水无法分层，溶液较为浑浊，造成过滤困难；以乙腈和乙酸乙酯为提取溶剂时，在加入盐的情况下，乙腈和乙酸乙酯均能和水分层，但乙酸乙酯和正己烷互溶[10]，因此无法实现加入正己烷以进一步除去杂质的目的。因此，选择乙腈为提取溶剂。另外，在加入提取剂乙腈之前，加入饱和氯化钠和正己烷，能去除样品基质中极性强的杂质（溶于水相）及非极性和部分弱极性的杂质（溶于正己烷相）[11]，达到较好的净化效果。因此，本实验选择乙腈、饱和氯化钠、正己烷三相溶剂体系，样品能得到较好的快速提取与净化。

3.2 流动相的优化

分别考察了水-乙腈，0.1 %乙酸水溶液-乙腈，0.1 %乙酸水溶液-0.1 %乙酸乙腈溶液3种流动相体系梯度洗脱，结果显示，在流动相中加入少量乙酸，有利于化合物离子化，提高灵敏度，以0.1 %乙酸水溶液-0.1 %乙酸乙腈溶液为流动相质谱响应最好，梯度洗脱可得到良好的分离效果和峰形。

3.3 质谱条件的优化

糖皮质激素是具有甾醇母核的一类化合物，化学结构相似，分离具有一定的难度。由于41种待测化合物均在正离子模式下有较强的质谱响应，因此选择正离子扫描模式。通过对电压、碰撞能量、离子源温度、脱溶剂气温度、碰撞气压力等一系列质谱参数进行优化，确定最佳的质谱条件。最终在MRM模式下，使结构性质相近的上述各化合物能达到较好地分离，各通道之间无明显干扰，使从膏霜类化妆品中快速提取检测41种可能的非法添加化合物的方法成为可能。41种糖皮质激素的提取离子色谱图见图1。

图1 41种糖皮质激素的提取离子色谱图

3.4 专属性试验

分别考察了混合对照品工作液、阴性空白溶液和供试品溶液（氢化可的松、曲安奈德、氟米龙醋酸酯、倍氯米松双丙酸酯阳性样品）的色谱图。结果显示，阴性空白样品的主要色谱峰在1 min之前，对41种糖皮质激素的筛查不存在干扰，典型色谱图见图2。有部分色谱峰保留时间较为接近，部分重合，尤其在4～5 min和14～15 min 之间，对于这几种成分的疑似阳性样品可通过超高效液相色谱-四极杆-串联质谱进行确认。

3.5 线性关系、检出限和定量限

图2 专属性色谱图

用空白基质配制6个水平的混合标准工作溶液（1～200 μg/L），在优化的色谱-质谱条件下测定。以各化合物定量监测离子对色谱峰峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得线性方程和相关系数（r）。结果表明 41种化合物在各自的质量浓度范围内与色谱峰峰面积均呈良好的线性关系，r均大于0.99。在空白基质中添加一定浓度的41种糖皮质激素混合标准溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度分别作为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表2。结果显示，这41种待测物的LOD和LOQ分别为1～2 μg/kg和3～7 μg/kg。

3.6 回收率和精密度

在空白基质中添加41种糖皮质激素混合标准溶液，添加水平分别为10，20，100 μg/kg，每个添加水平平行测定6次，计算每个待测物的平均回收率和RSD，见表2。结果显示，方法的平均回收率为73.8 %～104.6 %（n=6），RSD为3.6 %～9.7 %（n=6）。

表2 41种糖皮质激素线性方程、相关系数、LOD、LOQ、精密度及回收率

33 哈西奈德 y=2.963×105x+6.627×104 0.9993 1 3 8.4，7.9，5.7 89.7，92.8，94.4 34 阿氯米松双丙酸酯 y=5×104x+3.174×104 0.9980 2 7 4.9，5.4，4.3 86.9，92.5，94.6 35 安西奈德 y=5.509×104x-2.054×104 0.9953 2 7 4.6，3.2，3.9 75.8，87.4，93.8 36 氯倍他索丙酸酯 y=7.273×105x+8.492×104 0.9981 1 3 8.8，7.1，5.3 83.7，92.7，97.9 37 氟替卡松丙酸酯 y=3.058×104x+1.019×104 0.9964 2 7 9.2，6.9，5.3 84.7，92.6，101.8 38 莫米他松糠酸酯 y=6.321×104x-2.319×104 0.9986 2 7 6.2，5.4，4.7 80.3，89.7，97.5 39 倍他米松双丙酸酯 y=1.125×105x-2.259×104 0.9983 1 3 9.7，6.8，5.2 81.5，89.4，92.6 40 倍氯米松双丙酸酯 y=1.912×105x+1.742×105 0.9994 1 3 6.7，7.2，5.7 76.2，86.9，94.3 41 倍氯他松丁酸酯 y=4.432×104x+2.999×104 0.9975 2 7 5.4，4.6，3.6 83.4，90.5，97.5

3.7 方法应用

利用本方法对购买的30批次的膏霜类化妆品进行筛查分析，在两个批次样品中检出违禁添加的糖皮质激素，分别为倍他米松247 μg/kg，曲安奈德醋酸酯428 μg/kg。利用国标GB/T24800.2-2009 方法[12]同时对这30批次样品进行测定，检出结果与本方法一致，检出的含量为倍他米松269 μg/kg，曲安奈德醋酸酯403 μg/kg，与本方法测定的含量差异较小。由此可见，利用本方法对膏霜类化妆品中糖皮质激素进行筛查和定量是可行的。

4 讨论

本实验利用超高效液相色谱-四极杆-串联质谱对膏霜类化妆品中的41种糖皮质激素物质进行筛查，在25 min内完成了对41种糖皮质激素较好的分离，该方法前处理简便、抗干扰性强，灵敏度高，可为批量快速检测膏霜类化妆品中糖皮质激素提供方法参考和数据支持。