G1-熵权法结合正交试验优选银怡片水提工艺

刘洪波，王秋菊，高如意，曹苗苗，

（江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001）

银怡片是针对中老年女性等骨质疏松人群开发的具有增加骨密度功能的保健食品，由葛根、骨碎补、柠檬酸钙、硫酸软骨素等组成。其中葛根、骨碎补经水提、浓缩、干燥得到干膏粉，再与配方中其他原料混合制成片剂。配方中葛根为药食同源中药，味甘、辛、凉，归脾、胃、肺经，具有与雌二醇相当的抗骨质疏松作用，为预防和治疗女性闭经后骨质疏松症安全而有效的原料[1-4]。骨碎补为可用于保健食品的中药，味苦性温，归肝、肾经，有补肾强骨、调节骨代谢的功能，广泛用于预防和治疗骨质疏松症[5-8]。本实验应用G1-熵权法结合正交试验，以加水量、提取时间和提取次数为考察因素，以葛根素、总黄酮提取量和出膏率为评价指标，优选银怡片的最佳水提工艺，以期筛选出合理可行的工艺参数，为其进一步生产及应用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

98-1-B型电子调温电热套（天津泰斯特）；UV-2700紫外分光光度计（日本岛津）；Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦）；JY电子天平（深圳华测）；HWS26型电热恒温水浴锅（上海一恒）。

1.2 材料

葛根素对照品（含量：95.5 %，中国食品药品检定研究院，批号110857-201412）；芦丁对照品（含量：92.6 %，中国食品药品检定研究院，批号10080-201409），甲醇（色谱纯，上海星可），其他试剂为分析纯，水为去离子水。

葛根（批号 Y1708051，产地：陕西）为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根；骨碎补（批号Y1709052，产地：贵州）为水龙骨科植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze) J.Sm.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 提取液的制备

按配方称取葛根138 g，骨碎补138 g，置入5000 ml圆底烧瓶，加12倍水回流提取2次，每次2 h。滤过，合并提取液，即得。

2.2 葛根素的含量测定[9]

2.2.1 色谱条件 Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇-水溶液（25:75），检测波长250 nm，柱温30 ℃，进样量10 μl，流速1.0 ml/min。理论塔板数按葛根素峰计算应不低于4000。

2.2.2 对照品溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加30 %乙醇制成3.091 mg/ml 溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取2.1项下提取液，摇匀，0.22 µm微孔滤膜（水膜）滤过，取续滤液即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按2.1项提取方法制备葛根阴性提取液，供试品溶液制备方法同2.2.3项，得阴性样品溶液。

2.2.5 专属性实验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，按2.2.1项色谱条件测定，结果显示，阴性无干扰。

图1 对照品（A）、供试品（B）、阴性样品（C）的HPLC图谱

2.2.6 线性关系的考察 精密吸取2.2.2项下对照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 ml，置入10 ml量瓶，以30 %乙醇定容，按2.2.1项色谱条件测定色谱峰面积，以对照品浓度C（μg/ml）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，葛根素回归方程为A=44 715C-215.93，R2=0.9999，在0.3091～2.4728 mg/ml浓度范围内，葛根素峰面积值与浓度具有良好线性关系。

2.2.7 精密度试验 取葛根素对照品溶液（0.6182 mg/ml），注入高效液相色谱仪，连续进样6次，峰面积RSD为0.59 %，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取供试品溶液，按2.2.1项色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样检测，结果葛根素的峰面积RSD为1.09 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取2.1项下提取液，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.2.1项色谱条件测定，结果葛根素含量均值为0.8365 mg/ml，含量RSD为0.27 %，表明方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密吸取已测含量的提取液2.5 ml，置入5 ml量瓶，平行6份，分别精密加入2 mg/ml葛根素对照品溶液1 ml，加水定容至刻度，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项色谱条件测定，计算葛根素回收率，平均回收率为99.87 %，RSD为0.88 %。说明该检测方法准确，符合要求。

2.3 总黄酮的含量测定[10]

2.3.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成浓度为52.78 µg/ml的对照品储备溶液。精密吸取储备溶液3.0 ml于10 ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为15.834 μg/ml的对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 吸取2.1项下提取液2 ml于蒸发皿中，加入1 g聚酰胺粉吸附，水浴挥干，然后转入层析柱。先用20 ml石油醚（30～60 ℃）洗，弃去石油醚液，然后用甲醇洗脱，定容至25 ml，即得。

2.3.3 检测波长的选择 取芦丁对照品（15.834 μg/ml）、供试品、空白（甲醇）3种溶液，在200～500 nm范围内进行扫描，观察各溶液最大吸收波长。由图2可知，芦丁对照品溶液、供试品溶液的最大吸收波长分别为359和375 nm，且在360 nm处有较大吸收，而空白溶液在此波长下无吸收。《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）中“保健食品中总黄酮的测定”中规定的检测波长为360 nm，故以360 nm为检测波长测定总黄酮含量。

图2 总黄酮紫外扫描图

2.3.4 线性关系的考察 精密吸取2.3.1项下对照储备溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml置入10 ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度分别为0，5.278，10.556，15.834，21.112，26.390，31.668 μg/ml系列标准溶液，用紫外分光光度计于波长360 nm处分别测定吸收度值。以浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得芦丁回归方程为A=0.026C+0.004，R2=0.9990，线性范围5.278～31.668 µg/ml。

2.3.5 精密度试验 取芦丁对照品溶液（15.834 μg/ml）于360 nm处测定吸光度，连续测定6次，吸光度RSD为0.07 %，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取供试品溶液，于0，30，60，90，120，150 min时测定吸光度，吸光度RSD为0.04 %，表明供试品溶液在150 min内稳定。

2.3.7 重复性试验 取2.1项下提取液，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，测定吸光度，结果总黄酮含量均值为12.016 μg/ml，含量RSD为0.05 %，表明方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密吸取已测含量的提取液2.5 ml，置入5 ml量瓶，平行6份，分别精密加入31.668 μg/ml芦丁对照品溶液1 ml，加水定容至刻度，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算总黄酮回收率，平均回收率为98.82 %，RSD为1.76 %。表明该检测方法准确，符合要求。

2.4 出膏率测定

精密量取供试品V1（ml），置入已恒定质量的蒸发皿（M1）中，在水浴锅上蒸至近干，转移至烘箱内，105 ℃干燥至恒定质量，取出，置干燥器中冷却至室温，迅速精密称定质量（M2），计算出膏率。

出膏率=（M2-M1）V2/mV1

式中m为供试品中生药总质量，V2为供试品的总体积。

2.5 正交试验

在预试基础上，按照配方称取276 g药材饮片，共9份，以加水倍量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，以葛根素提取量（供试品中葛根素的质量/对应葛根药材的质量）、总黄酮提取量（供试品中总黄酮的质量/对应处方药材的质量）和出膏率的综合评分为评价指标，按L9（34）正交试验因素水平表进行试验，采用G1-熵权法计算各指标权重，进行提取工艺优化。因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平

根据G1法，对3项评价指标的重要程度进行排序，其顺序关系为葛根素提取量＞总黄酮提取量＞出膏率，并确定各指标的权重评价标度为r2=1.4，r3=1.2，由下列计算公式（1）～（2）求得各指标的主观权重值w1。根据各提取工艺试验数据，采用公式（3）～（5）计算各指标客观权重值w2。采用公式（6）计算各指标的组合权重w，采用公式（7）最终求得各评价对象的综合评分[11]。各指标权重见表2，结果见表3，方差分析见表4。

由表3可知，各因素对综合指标的影响主次顺序为C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞加水倍量，由表4可知，C因素差异有统计学意义，提取次数3水平最佳，A和B因素差异无统计学意义，选择加水倍量10倍，提取时间1.5 h。综合直观分析和方差分析结果，最佳提取工艺为A2B2C3，即每次加10倍量水，提取3次，提取时间为每次1.5 h。

表2 提取工艺评价指标权重值

表3 正交试验安排及结果

表4 综合评价指标的方差分析

2.6 验证试验

为确证该工艺的稳定性，按配方称取葛根、骨碎补饮片各138 g，共3份，根据优选的工艺条件进行3批验证试验，结果见表5。

表5 验证试验结果

由表5可见，3批验证数据无显著差异，表明优化后的提取工艺稳定可行。

3 讨论

在提取工艺中，G1-熵权法既可反映各评价指标在不同提取条件下的变化规律，又可同时兼顾决策者的主观性，提高了数据的合理性和结果的科学性，故本研究采用G1-熵权法对葛根素提取量、总黄酮提取量和干膏率3个评价指标进行赋权，计算其综合评分。

采用传统的水提工艺提取银怡片中葛根、骨碎补，通过现代技术对其提取工艺进行筛选，最终确定提取工艺参数。验证试验结果表明，优化后的提取工艺稳定可行，为银怡片的进一步开发及工业化生产奠定了基础。