电针联合康复训练调控PI3K／Akt 信号通路介导脑缺血后血管新生相关因子的表达

姚文超 ，李梦醒 ，刘 箐 ，童明月 ，何 鹏 ，唐 巍 *

1 安徽中医药大学体育部，安徽 合肥 230012；

2 安徽中医药大学针灸推拿学院（康复医学院），安徽 合肥 230012；

3 安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥230012

缺血性脑卒中是影响全球健康的主要公共卫生问题，我国40～74 岁居民首次脑卒中标化发病率平均每年增长8.3%［1］。 脑缺血后神经功能的恢复一直是学科领域研究热点。 研究发现，有效时间内恢复缺血半暗带区血供，重建神经血管单元可为脑卒中恢复提供新的机会［2］。 本项目组致力于综合康复手段对脑缺血大鼠神经功能改善的研究，观察到以针刺联合丰富康复训练效果更优［3-4］，且在改善神经功能方面涉及血管新生相关因子的表达［5-6］，但这些因子如何影响到血管新生的具体环节尚未深入研究。 故本实验在前期研究基础上，建立右侧大脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，拟通过观察电针联合康复训练（针康疗法）在促进脑功能恢复中对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、脑源性神经营 养 因 子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及下游转导通路磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）／蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）的影响，深入阐释针康疗法促进脑缺血后血管新生的机制，以期为针康疗法应用于治疗脑缺血损伤提供实验参考。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF 级雄性 SD 大鼠 81 只，购于安徽省实验动物中心［许可证号 SCXK（皖）2019_002］，体质量（300±20）g。 实验大鼠术前 1 周常规喂养，术前 12 h禁食不禁水。 实验遵守科技部制定的《关于善待实验动物的指导性意见》和安徽中医药大学动物使用和管理委员会有关章程。

1.2 实验试剂

Anti-VEGF、Anti-BDNF（英国 Abcam 公司）；山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG FITC 二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；小鼠抗大鼠IgG、CD34-PE（ICO115-PE）（Santa Cruz，美国）；Anti-FLK-1、PI3K、phospho-Akt（Ser473）（美国 CST 公司）；总 RNA 提取试剂（trizol TaKaRa 公司）；RT-PCR 技术盒（TaKaRa公司）；PCR Mix（重庆升博生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器

双极电凝器（北京贝林电子有限公司）；H-800透射电镜、Leica RM2135 切片机、TK-218I 恒温摊片烤片机、包埋机（德国 Leica）；显微镜（日本Nikon）；DP-801 形态学显微图像分析系统（江苏捷达科技发展有限公司）；PowerPac 1000 电泳系统、凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；华佗牌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）；华佗牌SDZ-V 多功能电针治疗仪（江苏省苏州华佗医疗器械有限公司）。

2 实验方法

2.1 模型制备及分组

将81 只实验大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和电针联合康复训练组（针康联合组），每组 27 只。 参照 Zea Longa 等［7］线栓法建立 MCAO模型。 大鼠经异氟烷（诱导浓度4%，维持浓度2%）吸入麻醉后，大鼠颈部正中稍靠右处做一纵行切口，逐层分离皮下组织，暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，尼龙线从颈外动脉与颈内动脉分叉处起始插入，稍遇阻力即停止，打结、固定。 假手术组仅作颈动脉分离，不插线。

术后待大鼠清醒后，采用改良mNSS18 分制评分标准［8］评估神经功能缺损程度，选取评分为2～18 分的大鼠入模型组和针康联合组。

2.2 干预方法

选取百会、风府、心俞（左侧）和内关（左侧）4 个穴位（定位参考《大鼠穴位图谱的研制》［9］）。 待术后4 h 即予电针治疗，皮筋固定大鼠于鼠板，0.30 mm×25 mm 毫针针刺，接电针治疗仪。 百会、风府为1 组，心俞、内关为1 组，近心端腧穴接正极，远心端腧穴接负极。 电针参数：疏密波，频率4～20 Hz，输出电压 2 V，输出电流 0.5 mA，1 次／d，时间 20 min，连续治疗14 d。 造模前，将针康联合组大鼠置于跑台进行适应性跑步3 d，速度分别设置12 m／min，时间30 min／d。 术后当日，针康联合组给予 5 m／min、30 min／d 跑台训练，术后 1～3 d 跑台速度为 8 m／min，3 d 后调整至 12 m／min。

假手术组和模型组均同等条件抓取、固定，不给予任何治疗。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 透射电镜观察缺血区神经元超微结构 干预结束后取大鼠，异氟烷吸入麻醉后，断头取脑，冰上分离缺血侧海马组织，预冷的生理盐水充分漂洗，取出吸干后迅速置入避光戊二醛溶液中。 双蒸水洗2 次，逐级丙酮脱水，浸透、包埋、修块，超薄切片机切取厚度60 nm，枸橼酸铅、醋酸铀双重染色，H-800 透射电镜观察神经元结构并摄片。

2.3.2 免疫组化法和Weidner 法观察微血管密度（microvessel density，MVD） 同上述麻醉步骤后，0.9%氯化钠溶液快速灌冲心脏，断头、取脑，4%多聚甲醛溶液保存脑组织。 48 h 后取出，行脱水、石蜡包埋、切片（厚约 4 μm）、摊片、烤片等常规步骤，添加 CD34 一抗、二抗，孵育、显色、封片。 高倍镜（×400 倍）观察，以棕黄色颗粒沉积物为CD34 阳性表达。 镜下随机取5 个视野中CD34 阳性细胞的平均值表示微血管密度。

2.3.3 Western blot 法检测 VEGF、BDNF、PI3K、Akt的相对表达量 同上述麻醉步骤后，断头、冰浴下取脑缺血半暗带组织，加入RIPA 细胞裂解液，研磨后冰上静置，4 ℃、12 000 r／min 离心 15 min 后提取组织总蛋白质，－80 ℃冰箱保存。 按BCA 蛋白定量试剂盒说明，测定蛋白浓度。以1∶4 比例将5×SDSPAGE 凝胶加入蛋白样品中，沸水加热至蛋白充分变性。 SDS-PAGE 电泳分离目的蛋白（120 V，1 h），转膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h 后，将膜转移至含有检测蛋白一抗的封闭液中，4 ℃孵育过夜。 TBST 液洗膜后按一抗标签加入相应的二抗，室温孵育2 h，洗膜。 采用ECL 进行显色，压片曝光、定影，最终进行条带分析。 运用Image J 软件分析目标条带灰度值，以各目的条带蛋白与内参蛋白β-actin 表达量比值作为其相对表达量。

2.3.4 RT-PCR 法检测 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA的相对表达水平 取部分上述-80 ℃保存的脑缺血半暗带组织，采用Trizol 法提取总RNA 后进行反转录，将反转录出的cDNA 保存于-80 ℃冰箱备用。荧光定量 PCR 测定 VEGF、BDNF、PI3K 及 Akt mRNA的相对表达量。 反应步骤为：95 ℃预变性 1 min，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 10 s，共循环 40 次。 β-actin为内参基因，按照2-△△Ct法处理、分析数据，计算各实验指标mRNA 的相对表达水平。

2.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。 计量资料用（）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，组内前后比较采用配对t 检验，采用重复测量方差分析检验各指标随时间的变化情况。 P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 3 组大鼠各时间点脑缺血区神经元超微结构比较

假手术组神经元胞质内细胞器、自噬泡、溶酶体排列清晰，细胞核饱满、染色质均匀，核膜完整、内外结构清晰。 模型组神经元形态不规则，细胞空泡样变，核糖体、自噬泡减少，线粒体肿胀、空泡，细胞核固缩、核膜皱缩间隙增宽，染色质高度聚集，细胞边界不清。 针康联合组各时间点（3、7、14 d）神经元胞膜趋向完整，线粒体、粗面内质网、自噬泡分布均匀，仍可见部分萎缩的细胞器，但结构及空泡样变较模型组有较大改善。 见图1。

3.2 3 组大鼠各时间点脑缺血区MVD 计数比较

以棕黄色CD34 阳性细胞为新生血管标记物。脑缺血区域MVD 计数在不同分组间差异具有统计学意义（FIntergroup＝141.762，P＜0.001），不同时间点的变化趋势差异具有统计学意义（FTime＝81.920，P＜0.001），两者具有明显交互作用（FInteraction＝44.960，P＜0.001）。

控制时间因素，进行组间比较，结果显示，针康联合组在 3、7、14 d 时，均高于其他 2 组，差异有统计学意义（P＜0.01），说明缺血、缺氧环境启动内源性机制，诱导缺血半暗区微血管新生，但鉴于其自身修复能力有限，介入电针联合康复训练可增加新生微血管密度计数，促进血管再生。 控制分组因素，进行组内各时间点比较，结果显示，假手术组和模型组各时间点差异无统计学意义（P＞0.05），针康联合组3 d 与7、14 d 比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。假手术组和模型组改变趋势为先上升后下降，针康联合组为持续上升趋势，据此推断，无外界干预刺激的情况下，新生微血管增长速度比较缓慢，康复手段的早期介入，可持续、有效促进缺血损伤后血管新生。 同时，有效时间内治疗效果与疗程呈正相关性，提示适当延长疗程利于脑缺血后的康复。 见图 2、表 1。

3.3 3 组大鼠各时间点脑缺血区 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白表达比较

大鼠缺血区脑组织 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白重复测量的方差分析，各变量在不同分组间差异均具有统计学意义（P＜0.001），不同时间点的变化趋势差异均具有统计学意义（P＜0.001），两者具有明显交互作用（P＜0.001）。

控制时间因素，进行组间比较，针康联合组在3、7、14 d 时的蛋白表达，均高于其他 2 组，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示脑卒中后的缺血、缺氧微环境，可诱导 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 因子的表达，参与脑缺血后神经、血管系统重构，针康疗法的介入使得机体自行修复效果得以增强。 控制分组因素，进行组内各时间点比较，结果显示，假手术组各时间点差异均无统计学意义（P＞0.05）；模型组7 d 时VEGF、Akt 蛋白表达增加，与 3、14 d 比较，差异均具有统计学意义 （P＜0.05）； 模型组 7 d 时 BDNF、PI3K 蛋白表达高于3 d 时，差异均具有统计学意义（P ＜0.01）； 针 康 联 合 组 14 d 时 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白表达增加明显，与 3、7 d 比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。假手术组和模型组呈先上升后下降趋势，针康联合组则持续攀升，提示在14 d 的疗程范围内，相关因子表达在针康疗法作用下，随治疗时间累积。 见图3 和表2～5。

3.4 3 组大鼠各时间点脑缺血区VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA 表达比较

大鼠缺血区脑组织 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA重复测量的方差分析，各变量在不同分组间差异均具有统计学意义（P＜0.001），不同时间点的变化趋势差异均具有统计学意义（P＜0.001），两者具有明显交互作用（P＜0.001）。

控制时间因素，进行组间比较，针康联合组在3、7、14 d 时的 mRNA 表达，均高于其他 2 组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。 在控制分组因素方面，进行组内各时间点比较，结果显示，假手术组3、7、14 d时 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA 表达差异均无统计学意义（P＞0.05）；模型组 VEGF mRNA 表达7 d与14 d 时比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；BDNF mRNA 表达 3 d 与 7、14 d 时比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；PI3K mRNA 表达 3 d 与 7 d时比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；针康联合组中，VEGF、BDNF mRNA 表达，7 d 与 3、14 d 时比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；PI3K mRNA表达3 d 与7 d 比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。针康联合组 7 d 时 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA表达增加明显，与3、14 d 比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；各变量 mRNA 表达组别×时间均有明显交互作用（P＜0.001）。

以上结果表明，脑缺血后机体通过上调VEGF、BDNF、PI3K、Akt 因子表达，诱导血管新生。 模型组和针康联合组均呈现先上升后下降趋势，于7 d 时表达至峰值，说明在治疗7 d 时相关因子表达进入旺盛期， 提示可选择7 d 作为疗效观察点， 虽然在14 d 时有所衰减，但血管新生因子的表达及作用随疗程延长而持续发挥，此与MVD 计数和相关蛋白表达结果趋同。 见表6～9。

4 讨 论

缺血性脑卒中属中医学“中风”范畴，基本病机为脏腑阴阳失调，气血逆乱，上犯于脑。 脑缺血再灌注后神经元水肿、坏死，线粒体、内质网等细胞器结构和功能异常，造成神经功能障碍。 本实验通过透射电镜发现，模型组神经元多见空泡样变，线粒体肿胀，细胞核固缩，提示缺血可造成神经元结构损伤，模型建立成功。 同时，神经元启动自身修复机制，细胞结构趋于改善，但仍存在一定局限性，电针联合康复训练对缺血区神经元结构改善有积极的促进作用。

表1 3 组各时间点脑缺血区MVD 计数比较（）Table 1 Comparison of MVD counts in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01.

7 d 7.67±0.58 19.00±1.731）27.33±2.081）2）3）141.762，0.000 81.920，0.000 44.960，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 7.33±0.58 16.00±1.001）20.00±1.731）2）14 d 7.00±1.00 17.67±2.081）29.33±1.151）2）3）

表2 3 组各时间点脑缺血区VEGF 蛋白的表达（）Table 2 Expression of VEGF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表2 3 组各时间点脑缺血区VEGF 蛋白的表达（）Table 2 Expression of VEGF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01；与组内 7 d比较，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 0.313±0.109 0.625±0.0401）3）1.175±0.0181）2）3）398.772，0.000 100.462，0.000 85.121，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.290±0.023 0.454±0.0141）0.804±0.0361）2）14 d 0.262±0.035 0.471±0.0341）4）1.391±0.0501）2）3）4）

表3 3 组各时间点脑缺血区BDNF 蛋白的表达（）Table 3 Expression of BDNF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表3 3 组各时间点脑缺血区BDNF 蛋白的表达（）Table 3 Expression of BDNF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01，4） P＜0.05；与组内 7 d 比较，5） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 5) P＜0.05.

7 d 0.387±0.032 0.739±0.0121）3）1.155±0.0341）2）4）903.082，0.000 53.714，0.000 41.797，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.369±0.036 0.523±0.0141）0.927±0.0411）2）14 d 0.360±0.045 0.622±0.0421）1.556±0.1011）2）3）5）

脑卒中发生后促进血管的生成利于神经发生和功能恢复。 目前，诸多学者对神经血管单元相关靶点开展研究［10］，认为促进脑缺血后血管新生，尽快恢复缺血区的血液供应， 挽救濒临死亡的神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞，可能成为一种保护缺血脑组织、促进功能恢复的新手段［11-12］。

针刺治疗脑卒中疗效肯定，多项研究表明电针可促进MCAO 大鼠血管新生相关因子表达［13-14］。病变在脑，首取督脉。 张锡纯在《医学衷中参西录》中指出：“神明之体藏于脑，神明之用发于心”，提出心脑相通的理论，心脑共主神明，心脑疾病可通过心脑同治进行治疗［15］。 百会为手足少阳、足太阳、足厥阴与督脉之会，有补神益智、开窍启闭之功；风府为督脉、足太阳、阳维之会穴，可通督醒脑，调动五脏六腑之精气；心俞属足太阳膀胱经，为调理“心”脏要穴；内关为八脉交会穴之一，主阴主血，可使心、脉、血及神相互联系，具有宁心安神之效。 依据以上理论， 本研究针刺处方选用督脉经穴百会、风府，辅以心俞、内关，电针治疗以醒神开窍、调督通络。 跑台训练能促进梗死灶边缘神经血管单元超微结构的修复［16-17］。电针与康复训练的联合应用，是中医康复方法与现代康复技术的优化结合［18］。 故本实验采用电针联合康复训练治疗脑缺血大鼠，具备“针康同步、整体康复”的优势。 实验发现，针康联合组细胞膜逐渐趋向完整，多数细胞器分布均匀、结构较模型组有较大改善，治疗14 d 时部分细胞结构趋于完整，损伤程度较其他时间点有所减轻，提示针康联合疗法可改善梗死区神经元的坏死情况，增强其缺血区神经元的结构恢复，减轻缺血缺氧所致的脑组织损伤，这与刘荣等［19］的研究结果相一致。

表4 3 组各时间点脑缺血区PI3K 蛋白表达（）Table 4 Expression of PI3K protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表4 3 组各时间点脑缺血区PI3K 蛋白表达（）Table 4 Expression of PI3K protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01，4） P＜0.05；与组内 7 d 比较，5） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 5) P＜0.05.

7 d 0.479±0.007 0.763±0.0061）3）1.410±0.0571）2）4）2 312.264，0.000 106.552，0.000 76.208，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.445±0.011 0.563±0.0121）1.101±0.0091）2）14 d 0.456±0.024 0.620±0.0691）1.713±0.0351）2）3）5）

表5 3 组各时间点脑缺血区Akt 蛋白表达（）Table 5 Expression of Akt protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表5 3 组各时间点脑缺血区Akt 蛋白表达（）Table 5 Expression of Akt protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与模型组同一时间点比较，3） P＜0.01；与组内 3 d 比较，4） P＜0.01，5） P＜0.05；与组内 7 d 比较，6） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01, 2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time point, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 4) P＜0.01, 5) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 6) P＜0.05.

7 d 0.427±0.021 0.848±0.0131）4）1.555±0.0091）3）4）1 581.880，0.000 75.381，0.000 58.594，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.411±0.242 0.602±0.0211）1.205±0.0321）3）14 d 0.431±0.031 0.653±0.0472）6）1.922±0.1172）3）5）6）

表6 3 组各时间点脑缺血区VEGF mRNA 相对表达量（）Table 6 Relative expression of VEGF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表6 3 组各时间点脑缺血区VEGF mRNA 相对表达量（）Table 6 Relative expression of VEGF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01；与组内 7 d比较，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 1.00±0.10 1.52±0.061）3.44±0.121）2）3）445.845，0.000 100.343，0.000 72.631，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.09 1.38±0.191）2.28±0.201）2）14 d 1.01±0.13 1.41±0.021）4）2.35±0.161）2）4）

表7 3 组各时间点脑缺血区BDNF mRNA 相对表达量（）Table 7 Relative expression of BDNF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表7 3 组各时间点脑缺血区BDNF mRNA 相对表达量（）Table 7 Relative expression of BDNF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，3） P＜0.01；与组内 3 d 比较，4） P＜0.01，5） P＜0.05；与组内 7 d 比较，6） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.05, 2) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 4) P＜0.01, 5) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 6) P＜0.01.

7 d 1.00±0.06 1.34±0.062）5）3.00±0.202）3）4）427.743，0.000 13.984，0.000 10.317，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.07 1.24±0.021）2.17±0.322）3）14 d 1.01±0.12 1.28±0.021）4）2.36±0.322）3）6）

表8 3 组各时间点脑缺血区PI3K mRNA 相对表达量（）Table 8 Relative expression of PI3K mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表8 3 组各时间点脑缺血区PI3K mRNA 相对表达量（）Table 8 Relative expression of PI3K mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05.

7 d 1.01±0.11 1.36±0.071）3）2.94±0.281）2）4）918.388，0.000 9.162，0.003 4.354，0.017组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.01±0.10 1.23±0.051）2.59±0.061）2）14 d 1.01±0.13 1.29±0.051）2.61±0.071）2）

表9 3 组各时间点脑缺血区Akt mRNA 相对表达量（）Table 9 Relative expression of Akt mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表9 3 组各时间点脑缺血区Akt mRNA 相对表达量（）Table 9 Relative expression of Akt mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：与假手术组同一时间点比较，1） P＜0.01；与模型组同一时间点比较，2） P＜0.01；与组内 3 d 比较，3） P＜0.01；与组内 7 d比较，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 1.01±0.15 1.47±0.191）3.32±0.281）2）3）543.814，0.000 32.931，0.000 21.426，0.000组别假手术组模 型 组针康联合组干预措施（F 值，P 值）时间（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.08 1.31±0.061）2.17±0.211）2）14 d 1.00±0.08 1.34±0.091）2.57±0.201）2）4）

前期研究已证实，应用综合康复方法治疗脑缺血，可通过上调血管新生相关因子VEGF、VEGFR2、bFGF的表达，下调血管新生抑制因子ES、TSP-1 表达，促进血管新生；但这些因子在血管新生的具体环节中是如何作用，尚未有深入研究。VEGF 联系众多信号通路，在血管新生过程中发挥无可替代的作用［20］。BDNF 是一种神经营养类因子，支持多种神经元的存活、分化及生长发育，同时可诱导内皮细胞血管新生及Akt 的磷酸化，由其介导的血管新生与PI3K／Akt信号通路关系密切。 新血管的形成可通过内皮细胞表面特异性标记物来识别，主要表达于新生血管内皮中的CD34 特异性高，重复性好，用于脑缺血后血管新生的判断更为可靠。 因此本实验通过检测CD34 阳性细胞的表达计算MVD，用于观察MCAO大鼠缺血区血管新生情况。

本实验结果显示：VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白及mRNA 相对表达量和MVD 计数， 在不同分组间具有明显统计学意义，说明针康联合疗法在促血管新生相关因子、CD34 表达方面有明显优势，可使表达时相前移。 各组不同时间点的变化趋势差异明显，以7 d 为重要观察点，针康联合疗法的介入使机体在自行修复基础上，效果得以最大化，且在有效时间内治疗效果与治疗时程呈正相关。 贾蓝羽等［21］研究发现缺血7～12 d 后可观察到毛细血管分支的内皮细胞24 h 开始增殖并持续至少7 d 的研究结果与本实验趋同。 干预措施与时间均具有明显交互作用给予启示，临床治疗缺血性脑卒中，康复手段的介入和有效治疗时间的选取，至关重要。

本实验表明：电针联合康复训练可通过调控脑缺血后血管新生相关因子VEGF、BDNF 的表达，激活下游PI3K／Akt 信号通路，介导血管新生，以促进神经功能恢复。这在一定程度上明确了PI3K／Akt 信号通路的关键作用，为脑内血管新生与神经功能恢复的关系，丰富脑缺血功能恢复的生物学机制研究，提供实验依据。 针康联合疗法促进脑内血管新生机制中，有无涉及MicroRNA 信号调控尚不清楚，这也是下一步需要深入研究、探讨的重要内容。