三株丝状真菌复合发酵金针菇菌糠生产饲用复合酶制剂的研究

■张庆华 赵新海 钟丽娟 关艳丽 郝 捷 方 新

（1.辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000；2.内蒙古昆明卷烟有限责任公司，内蒙古呼和浩特010020）

随着畜牧业的发展，我国饲料资源日益紧缺，开发地源性非常规饲料资源成为重要途径之一[1]。同时随着我国人民的生活水平日益提高，饮食结构逐渐改变，对食用菌的需求量逐年增加，使得食用菌产业飞速发展，每年约可产生5 800万吨的菌糠[2]。菌糠是食用菌生产过程中产生的废弃物，虽然营养价值丰富，但产区分布具有地域性，应用少且饲用价值不明确，因此被归类为非常规饲料。菌糠含有丰富的纤维素、粗蛋白等营养物质，菌糠资源二次利用的研究越来越受关注。大量研究表明，利用微生物发酵菌糠的研究多集中在制备动物蛋白饲料方面[3]，利用金针菇菌糠制备饲用复合酶制剂的研究较少，针对金针菇的营养成分特点，本研究利用两株黑曲霉和一株米曲霉复合发酵金针菇菌糠，生产富含纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的复合酶制剂，有效改善了单一菌种酶系单一、酶活力低的弊病。同时米曲霉和黑曲霉作为活菌制剂[4]，有助于促进动物肠道乳酸菌菌群的生长，减少动物粪便排泄物中大肠杆菌的数量，从而有利于动物的健康成长。将该酶制剂用于肉鸡饲喂试验，肉鸡采食量、日增重、饲粮利用率等指标和对照组相比，差异显著，获得了较理想的饲喂效果，为菌糠和酶制剂的开发利用奠定了良好基础。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基及试验动物

黑曲霉(LW-9)、黑 曲霉(LW-08)、米曲霉(GY-2018-0038)为实验室保存菌种。

斜面培养基：PDA培养基；豆汁培养基。

混合发酵基础培养基：金针菇菌糠∶麸皮∶豆饼粉=60∶40∶5（金针菇栽培配方：麸皮25%，玉米芯73%，石膏1%,蔗糖1%）。

试验动物为AA商品代肉鸡。

1.2 混菌培养及其条件优化

菌种孢子悬液制备：将在PDA 斜面上培养4～5 d黑曲霉菌株和豆汁斜面培养4～5 d的米曲霉分别制成孢子数1.0×109个/l的孢子悬液。

混菌培养及其条件优化：采用单因子试验和响应面法对培养基和培养条件进行优化。每500 ml 三角瓶装干料20 g，混合菌种接种量10%，通过改变菌糠与麸皮的质量比、无机盐的添加量、豆粕添加量、三菌种的比例、培养时间等确定最优培养基和发酵条件。

1.3 酶活力测定

1.3.1 粗酶液制备

将发酵后的培养物于40 ℃烘干。称取一定量的固体酶样，按1∶10加水、40 ℃水浴摇床抽提30 min，用滤纸过滤，滤液即为粗酶液。依据发酵产物中纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活力大小进行二次稀释。

1.3.2 酶活力的测定

纤维素酶酶活力测定，按NY/T 912—2004方法测定；木聚糖酶酶活力按GB/T 23874—2009 方法测定；中性蛋白酶酶活力按GB/T 23527—2009方法测定。

1.4 动物饲喂试验

取1日龄健康AA商品代肉鸡368羽，按试验要求分成2组，每组两个重复，分别饲喂不含酶制剂（对照组）和含2 g/kg 酶制剂（酶制剂成分：纤维素酶活力2 549 U/g、木聚糖酶活力2 925 U/g 和中性蛋白酶的酶活6 679 U/g）的玉米-豆粕型日粮。日粮配方及营养水平见表1。试验鸡自由采食和饮水，试验期42 d。分别于1日龄和42日龄时称重以计算增重。每日记录耗料量、剩料量和死逃鸡只数，并对死逃鸡称重。

料重比=平均日采食量（g）/平均日增重（g）

表1 日粮配方组成及营养水平

1.5 试验设计和数据统计

运用DESIGN EXPERT和SAS软件进行试验设计和数据统计分析。根据单因素试验结果，以纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶为响应值，通过Design-Expert 10.0.3软件设计Box-Behnken 响应面试验。因素水平如表2所示。对纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶进行二次多元回归方程拟合，得到各因素与响应值之间函数关系的回归方程，根据生成响应面图确定最优的产酶发酵条件。

表2 响应面试验的因素和水平

1.6 响应面条件优化验证

按照Design-Expert10.0.3 软件优化得到混菌发酵最好的条件进行发酵试验，验证该方程拟合度。

2 结果与讨论

2.1 培养基中金针菇菌糠与麸皮的质量比对复合酶酶活力的影响

固定产纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌种的接种比例为1∶1∶1，混合菌种接种量10%。在发酵基础培养基中，通过改变菌糠与麸皮的质量比，确定其对复合酶酶活力的影响（见图1）。结果表明，麸皮对丝状真菌的产酶活性有较强的促进作用，随着麸皮在培养基中添加量的增加，纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活力逐渐增加，菌糠与麸皮质量比在6∶4 时，纤维素酶活力和木聚糖酶活力皆达到最大值，纤维素酶活力为3 046 U/g,木聚糖酶活力2 612 U/g；菌糠与麸皮的质量比在5∶5 和4∶6 时，中性蛋白酶活力达到最大值并趋于稳定。以中性蛋白酶酶活性为主，兼顾考虑纤维素酶和木聚糖酶酶活力，确定菌糠与麸皮质量最佳比为6∶4，三种酶的活力分别为3 046、2 612 U/g和5 905 U/g。

图1 金针菇菌糠与麸皮的质量比对复合酶酶活力的影响

2.2 豆粕添加量对复合酶酶活力的影响

在培养基中增加豆粕粉，为丝状真菌的生长提供有机氮源，有助于菌丝的生长[5]，但对三种酶的酶活力影响是不确定的。因此以培养基中菌糠与麸皮质量比6∶4为基础，固定产纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌种的接种比例为1∶1∶1，混合菌种接种量10%，其他因素不变，研究了豆粕粉添加量对混菌发酵复合酶酶活力的影响，结果见图2。由图2可见，豆粕粉的添加对纤维素酶活力和木聚糖酶活力影响不大，没有明显的促进和抑制作用。豆粕粉的添加对蛋白酶的活力有一定的促进作用，添加量为5%时，酶活力最高，达到6 542 U/g，之后随着豆粕粉的增加，中性蛋白酶活力逐渐下降，这可能与物料透气性和豆粕中含有中性蛋白酶的抑制因子有关[6]。综合三种酶的酶活力情况，豆粕粉的添加量为5%时，三种酶的酶活力分别为2 996、2 738 U/g和6 542 U/g。

2.3 无机盐(NH4)2SO4和NaH2PO4添加量对复合酶酶活力的影响

以培养基中菌糠与麸皮质量比6∶4为基础，固定产纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌种的接种比例为1∶1∶1，混合菌种接种量10%，豆粕粉的添加量为5%，其他因素不变，确定无机盐(NH4)2SO4和NaH2PO4添加量对复合酶酶活力的影响。每种酶都有自己的活性中心，无机盐离子对酶活性的提高和酶的稳定有较好的作用[7]。NaH2PO4对米曲霉中性蛋白酶活力有显著的促进作用，(NH4)2SO4的作用不明显。(NH4)2SO4对纤维素酶活力和木聚糖酶活力有促进作用，NaH2PO4对两株酶的酶活力无明显促进作用。通过试验确定(NH4)2SO4和NaH2PO4的最适添加浓度，使混菌发酵的复合酶酶活力达到最优比例，结果见图3和图4。以中性蛋白酶酶活力为主，兼顾考虑纤维素酶和木聚糖酶酶活力，当NaH2PO4和(NH4)2SO4添加量为0.2%、0.6%时，三种酶均可以得到优化，纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活力分别为3 025、2 876 U/g和6 533 U/g。

图2 豆粕添加量对复合酶酶活力的影响

图3 NaH2PO4添加量对复合酶酶活力的影响

图4 (NH4)2SO4添加量对复合酶酶活力的影响

2.4 三菌种接种比例对固态混菌发酵复合酶酶活力的影响

单一菌发酵时接种量的大小影响发酵酶活力的大小和发酵周期，接种量小，延迟期长，发酵周期长，易染菌；接种量高使菌体生长快，代谢产物积累多，也会产生代谢抑制现象，最终影响酶的活力。混菌发酵生产饲用复合酶时，不同的菌种生长速度不同，所以三种菌不同的配比会对复合酶中三种酶的酶活力有影响[8-9]，结果见图5。结果表明，不同配比的菌种对复合酶中纤维素酶活力基本无影响，对木聚糖酶和中性蛋白酶酶活力有显著的影响；当配比为3∶3∶4时，木聚糖酶活性最高，酶活力为2 580 U/g。当配比为2∶3∶5时中性蛋白酶活力最高，酶活力为6 011 U/g。以中性蛋白酶酶活力为主，兼顾考虑纤维素酶和木聚糖酶酶活力，选用三种菌种的合理配比为2∶3∶5时，三种酶的活力分别为2 805、2 549 U/g和6 011 U/g。

图5 三菌种接种比例对固态混菌发酵复合酶酶活力的影响

2.5 培养时间对复合酶酶活力的影响

以培养基中菌糠与麸皮质量比6∶4 为基础，固定产纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌种的接种比例为2∶3∶5，混合菌种接种量10%，豆粕粉的添加量为5%，其他因素不变，确定培养时间对复合酶酶活力的影响。不同的单一酶都有最佳的发酵周期，三种菌同时培养，互相促进，产酶的周期会发生变化[10-11]，混合菌种按最佳比例接种，研究了不同培养时间对复合酶酶活力的影响。从培养48 h起，每间隔8 h取样一次，测定不同培养时间三种酶的酶活力，结果见图6。结果表明，随着发酵时间的延长，三种酶皆呈先上升后下降趋势，纤维素酶和中性蛋白酶酶活力在72 h达到最大值，之后逐渐下降，蛋白酶较纤维素酶酶活力下降幅度大；木聚糖酶酶活力在80 h 达到最大，比72 h提高4%，提高幅度不大。以中性蛋白酶酶活力为主，兼顾考虑纤维素酶和木聚糖酶酶活力，选择72 h为复合酶制剂的发酵周期，三种酶的酶活力分别为3 254、2 226 U/g和6 182 U/g。

图6 培养时间对复合酶酶活力的影响

2.6 响应面法优化混菌发酵试验

2.6.1 模型建立及显著性分析

利用Box-Behnken 响应面优化培养条件，根据单因素试验结果，对菌糠∶麸皮的比例、豆粕的添加量和培养时间等三因素，以纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶酶活力为响应值，通过Design-Expert 10.0.3软件设计Box-Behnken响应面试验（见表3）。

该模型的决定系数R2=0.985 0，校正决定系数AdjR2=0.965 8，说明实际值和预测值拟合度比较好。由表4 以看出，该回归模型P＜0.000 1，这表明此二次模型影响极显著，失拟项的P=0.418 8＞0.05，模型失拟项影响不显著，说明无失拟因素存在，表明该模型在统计学上是有意义的。模型中B、C、BC、A2、B2、C2的P＜0.01，表明这些项对复合酶酶活力的影响极显著。A 的P＞0.05，表明对复合酶酶活力的影响不显著。一次项B、C 对产纤维素酶影响达到极显著水平，A 的影响不显著(P＞0.05)。交互项中只有BC 的P＜0.05，说明其他交互作用对复合酶中纤维素酶无显著性影响。

该模型的决定系数R2=0.985 1，校正决定系数AdjR2=0.966 0，说明实际值和预测值拟合度比较好。由表5 以看出，该回归模型P＜0.000 1，这表明此二次模型影响极显著，失拟项的P=0.434 5＞0.05，模型失拟项影响不显著，说明无失拟因素存在，表明该模型在统计学上是有意义的。模型中B、C、BC、A2、B2、C2的P＜0.01，表明这些项对复合酶酶活力的影响极显著。一次项A、B、C 对产木聚糖酶影响达到显著或极显著水平。交互项中只有BC 的P＜0.05，说明其他交互作用对复合酶中木聚糖酶无显著性影响。

表4 R1方差分析

表5 R2方差分析

该模型的决定系数R2=0.985 3，校正决定系数AdjR2=0.966 4，说明实际值和预测值拟合度比较好。由表6 以看出，该回归模型P＜0.000 1，这表明此二次模型极显著，失拟项的P=0.439 6＞0.05，模型失拟项不显著，说明无失拟因素存在，表明该模型在统计学上是有意义的。模型中B、C、BC、A2、B2、C2的P＜0.01，表明这些项对复合酶酶活性的影响极显著。一次项A、B、C 对产中性蛋白酶影响达到极显著水平。交互项中只有BC 的P＜0.05，说明其他交互作用对复合酶中的中性蛋白酶无显著性影响。

2.6.2 响应面交互作用分析通过Design-Expert10.0.3 软件，得到两因素交互作用的3D响应面曲线图。等高线的形状可反映出交互作用的强弱，椭圆形代表两因素交互作用显著，圆形则相反。由图7、图8、图9 可知BC 交互作用显著，AC、AB 交互作用不显著，均与表3、表4、表5 方差分析结果一致，并且响应面曲面开口向下，存在最大值，说明最佳点在考察的区域内。最后得到的优化培养条件为，菌糠∶麸皮的比例为1∶0.776，豆粕添加量为5.314%，培养时间为70.255 h,此时预测纤维素酶活力、木聚糖酶活力和中性蛋白酶的酶活力达到均衡，分别为2 587、2 974 U/g和6 726 U/g。

表6 R3方差分析

图7 三因素对纤维素酶酶活力响应面

图8 三因素对木聚糖酶酶活力响应面

图9 三因素对中性蛋白酶酶活力响应面

2.6.3 最优培养条件的验证试验

为方便实际操作，将2.6.2 发酵条件调整为，菌糠∶麸皮的比例为1∶0.77，豆粕添加量为5.3%，培养时间为70.2 h，按此条件进行试验，重复3次取平均值，测得三种酶的酶活力分别为2 549、2 925、6 679 U/g，与预测值的相对误差分别1.47%、1.65%和0.70%，说明模型能够有效反映各筛选因素对响应值的影响，具有实用价值。

2.7 复合酶饲喂试验效果分析

以本研究的粗酶制剂产品进行了动物饲喂试验研究。结果见表7和表8。

表7 复合酶制剂对肉鸡体重和平均日增重的影响

表8 复合酶制剂对肉鸡平均日采食量和料重比的影响

结果表明，试验组鸡只在42 日龄体重和平均日增重均高于对照组，料重比显著低于对照组，差异显著(P＜0.05)，该复合酶制剂具有酶系全、酶活高,尤其是蛋白酶活高的特点,在动物日粮中添加,可给动物直接补充饲料消化酶和非淀粉多糖酶,提高饲料分解率，增加动物吸收效果，从而提高饲料转化率,降低料重比,动物增重作用明显。

3 结果与讨论

通过响应面法和验证试验得到的结果，纤维素酶、木聚糖酶酶活力和中性蛋白酶酶活力分别为2 587、2 974 U/g 和6 726 U/g。结果表明，纤维素酶酶活力低于单因素实验中的酶活力，单因素实验中纤维素酶的平均酶活力为3 025 U/g。这可能是菌糠在配方中所占比例减小引起的。单因素试验表明，菌糠的添加量对纤维素酶的酶活力有较大的影响，两者比例为6∶4时，纤维素酶酶活力较高，可以达到3 000 U/g以上，而响应面得到的比例为1∶0.77，造成了纤维素酶酶活力偏低，但也符合以中性蛋白酶酶活力为主，兼顾考虑纤维素酶和木聚糖酶酶活力的筛选原则。在实际生产中，可以根据产品对酶活力的需求，适当调整菌糠和麸皮的比例，达到所需酶活力的范围。

本研究利用两株黑曲霉和一株米曲霉复合发酵金针菇菌糠，生产富含纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的复合酶制剂，饲喂时不需要再复配，简化了操作步骤，有效改善了单一菌种酶系单一、酶活力低的弊病。同时米曲霉菌和黑曲霉菌还可作为活菌制剂，有助于促进动物肠道乳酸菌菌群的生长，减少动物粪便排泄物中大肠杆菌的数量，从而有利于动物的健康成长。饲喂试验结果表明，试验组鸡只在42 日龄体重和平均日增重均高于对照组，料重比低于对照组，差异显著(P＜0.05)。研究结果表明，金针菇菌糠含有丰富的营养物质，是一个良好的饲用酶制剂生产原料，本研究解决了其被大量丢弃造成的环境污染，降低了生产成本，增加了经济效益，为菌糠和酶制剂的开发利用奠定了良好基础。

本研究表明，黑曲霉和米曲霉有较好的共生性，获得了较高酶活力的饲用复合酶制剂。通过单因素实验和响应面法，确定了三种丝状真菌复合发酵金针菇菌糠生产饲用复合酶制剂的培养基组成和培养条件。结果表明，三菌种的最佳合理配比为2∶3∶5，(NH4)2SO4添加量为0.6%、NaH2PO4添加量为0.2%，菌糠∶麸皮的比例为1∶0.77，豆粕添加量为5.3%，培养时间为70.2 h，三种酶的酶活分别为2 549、2 925、6 679 U/g。