复合植物水提物对奶牛乳房炎致病菌的体外抑制效果

■钟华晨 王丽芳 张三粉 宋 洁 郭晨阳 黄 洁

（内蒙古自治区农牧业科学院 资源环境与检测技术研究所，内蒙古呼和浩特010031）

奶牛乳房炎是由于微生物入侵乳腺组织引发的乳房炎症，分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是公认的奶牛乳房感染的病原体，金黄色葡萄球菌引发传染性乳房炎主要是通过挤奶工人以及挤奶工具等方式传播，大肠杆菌属于环境致病菌主要是通过垫料、粪便等途径感染[1]。

目前，关于奶牛乳房炎的预防和治疗主要使用抗生素以及非甾体类抗炎药。治疗效果主要取决于疾病的严重程度，药物选择，合理的药物用法和剂量，以及对诱发原因的抑制。关于使用抗生素来治疗乳房炎仍存在很多问题，持续存在的细菌以不同形式保护了它免受抗生素和宿主防御机制的侵害，它们可以复发为更具感染力的野生型表型，可能引起复发性感染[2]。此外，滥用抗生素会导致多重耐药性的发生，以及增加牛奶中存在抗菌素残留的风险，这使乳房炎成为对公共卫生极为重要的疾病[3]。长期大量使用抗生素会导致金黄色葡萄球菌和大肠杆菌携带有对抗菌药物产生耐药性的基因，并且这种耐药性会传播，引发更多的细菌产生耐药性，并且会出现严重的并发症，增加治疗成本[4]。

植物水提物具有无毒或低毒、不产生耐药性等特点[5]。植物水提物中富含有丰富的化学活性物质，主要包括黄酮类、皂甙、萜类、生物碱、有机酸等，具有提高机体免疫力、抗氧化能力、抑菌、抗炎、清热解毒等功效，逐渐被人们重视。

抗生素滥用乱用导致超级细菌及耐药性问题产生，因此国家出台政策明确了饲料端“禁抗”、养殖端“减抗、限抗”，并在194 号公告中规定2020 年药物饲料添加剂全部退出市场。鉴于此，本试验针对引发奶牛乳房炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行药敏试验研究，旨在研究用植物水提物代替抗生素抑制和杀灭病原菌，为防控奶牛乳房炎提供数据支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株采用本实验室冻存的标准菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、大肠杆菌（ATCC25922）。培养基：营养肉汤培养基、营养琼脂培养基，均购于北京陆桥技术股份有限公司；植物水提物购于南京泽朗公司；诺氟沙星胶囊购于石药集团欧意药业有限公司。

1.2 仪器设备

主要仪器包括：恒温培养箱（SPH150 型）购自上海精宏实验设备有限公司；振荡培养箱（FMS-100型）购自东京理化；高压蒸汽灭菌锅（MJ-54A）购自于美国STIK 公司；无菌操作台（YJ-875 型）购自苏州净化设备有限公司；牛津杯等。

1.3 试验方法

1.3.1 植物水提物的制备

将蒲公英提取物、金银花提取物、连翘提取物、益母草提取物分别选择其中四种、三种、两种按相同质量比为1∶1均匀混合配置成复合物，分别称取20 g溶解于超纯水中，配置成浓度为1 g/ml的混合植物水提物溶液，121 ℃、20 min超高压灭菌，后置于4 ℃备用。

1.3.2 供试菌液制备

将置于-80 ℃的菌株解冻后于营养肉汤培养基中37 ℃振荡培养18 h。将活化好的菌液划线于营养琼脂培养基上，37 ℃24 h 静置培养。挑取纯化后的单个菌株接种于营养肉汤培养基中37 ℃振荡培养18 h，作为原菌液。用灭菌生理盐水将金黄色葡萄球菌菌液浓度调节至1×106CFU/ml，大肠杆菌菌液浓度调节至1×105CFU/ml，作为供试菌液，备用。

1.3.3 牛津杯法体外测定抑菌活性

将制备好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的供试菌液移取0.1 ml于制备好的营养琼脂平板上，用无菌涂布棒将菌液涂匀，待其干燥后，用镊子将灭菌后的牛津杯放置于平板中，轻轻加压使其与培养基无缝接触，每个平板放置4个牛津杯，将其中3个牛津杯中加入相同的复合植物水提物作为试验组，另一个牛津杯中加入等体积的营养肉汤作为阴性对照，同时使用诺氟沙星作为阳性对照。将平板置于37 ℃培养箱静置培养24 h，按十字交叉法使用游标卡尺测量其抑菌直径，判断抑菌效果。

判定标准：抑菌效果判定标准均按《中药药理学》标准，即：抑菌直径≥20 mm 为极敏，15～19 mm 为高敏，10～14 mm为中敏，10 mm以下为低敏。

1.3.4 最小抑菌浓度（MIC）值的测定

采用二倍稀释法进行最小抑菌浓度（MIC）的测定，取10支灭菌后的试管，分别将其中加入2 ml营养肉汤，在第一支试管中加入配置好的浓度为1 g/ml复合植物水提物溶液制成水提物终浓度为500 mg/ml的培养液，均匀混合，吸取2 ml移入2号试管中，以此类推，稀释至第8 号试管，充分摇匀之后弃去2 ml。水提物浓度依次为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/ml。第9支为阳性对照，第10支为空白对照。在1～9号试管中分别加入制备好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌供试菌液50 μl，每种药物做3个重复，37 ℃振荡培养18～24 h。观察并且记录细菌生长结果，将试管内液体清澈明亮的浓度视为最小抑菌浓度。

1.3.5 最小杀菌浓度（MBC）值的测定

在MIC 值的基础上，吸取澄清透亮试管内的培养液50 μl 均匀涂抹于营养琼脂平板上，每个浓度重复3 次。37 ℃静置培养24 h，以杀灭99.9%数量级细菌(或活菌数≤5 个)的最小浓度视为最小杀菌浓度（MBC）[6]。

2 结果

2.1 复合植物水提物体外抑菌效果

不同复合植物水提物对金黄色葡萄球菌表现出不同的抑制效果，对大肠杆菌的抑制效果不明显（见表1）。

图1 不同复合植物水提物对金黄色葡萄球菌的抑制效果

图2 不同复合植物水提物对大肠杆菌的抑制效果

由表1、图1、图2 可知，金黄色葡萄球菌对复合植物水提物表现出高敏和中敏性，其中对金银花+蒲公英+益母草+连翘、连翘+蒲公英、金银花+蒲公英复合物高度敏感，抑菌圈直径分别为(15.70±0.60)、(15.33±0.29)、(15.17±0.76) mm；对连翘+益母草和金银花+连翘+益母草复合物的敏感性相对较低。大肠杆菌对复合物连翘+蒲公英、金银花+蒲公英+益母草+连翘表现出低敏性，抑菌圈直径为(9.67±0.58)、(9.30±0.60) mm，对其他复合植物水提物表现出耐药性。

2.2 最小抑菌浓度（MIC）值

采用二倍稀释法测定不同复合植物水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果见表2、表3。

表2 不同复合植物水提物对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC

表3 不同复合植物水提物对大肠杆菌的MIC和MBC

由表2可知，不同的复合植物水提物对奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用，其中复合物金银花+蒲公英+益母草+连翘对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显，将1 g/ml的复合植物水提物稀释256倍添加至培养液中，18 h之后培养液依然澄清透明，即有抑菌效果，MIC值为3.91 mg/ml，经营养琼脂培养基划线培养之后得出MBC值均为3.91 mg/ml；其次复合物金银花+连翘+益母草、金银花+连翘+蒲公英、蒲公英+金银花+益母草、金银花+蒲公英对金黄色葡萄球菌较为敏感，稀释256 倍时出现混浊，MBC值均为7.81 mg/ml。复合植物水提物连翘+益母草、蒲公英+益母草对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较弱，稀释16倍时培养液出现浑浊，即为有菌生长，MIC值均为125 mg/ml，经营养琼脂平板培养之后得出MBC值为125 mg/ml。

由表3可知，不同的复合植物水提物对奶牛乳房炎致病菌大肠杆菌存在一定的抑制效果，其中复合物连翘+益母草+蒲公英、连翘+蒲公英、金银花+蒲公英+益母草+连翘对大肠杆菌的抑制效果相对较为明显，将1 g/ml 的复合植物水提物稀释8 倍添加至培养液中，培养18 h 后，培养液澄清透明，视为无菌生长，MIC 值均为125 mg/ml，在营养琼脂培养基上划线培养24 h 后无活菌存在，得出MBC 值均为125 mg/ml；复合物金银花+连翘+益母草、金银花+连翘+蒲公英、金银花+益母草对大肠杆菌对的抑制相对不明显，MIC 值均大于500 mg/ml，经营养琼脂培养基划线之后得出MBC值均大于500 mg/ml。

3 讨论

抗生素是目前治疗奶牛乳房炎最普遍的药物，但是长期大量使用抗生素会引发严重的耐药问题，导致乳房炎治愈率下降为奶牛养殖业带来严重的经济损失[7]。植物水提物具有抑菌、消炎、抗氧化、不产生耐药性等功效，因此采用植物水提物预防和治疗奶牛乳房炎成为当下研究的热点[8]。试验通过对不同复合植物水提物对奶牛乳房炎主要病原微生物金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行体外抑菌试验，同时以普通营养肉汤作为阴性对照，诺氟沙星作为阳性对照，确保试验数据的可靠性。研究结果显示不同成分的复合物对不同病原微生物的抑制效果存在差异性。

3.1 牛津杯法测定抑菌活性

试验采用牛津杯法测定不同复合植物水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行体外抑菌效果的研究，结果显示，复合物金银花+蒲公英+益母草+连翘、连翘+蒲公英、金银花+蒲公英对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较好，复合物蒲公英+金银花+益母草、金银花+连翘、金银花+益母草抑菌效果次之，复合物连翘+益母草+蒲公英、金银花+连翘+蒲公英、蒲公英+益母草、金银花+连翘+益母草效果一般，复合物连翘+益母草相对于其他复合物而言对金黄色葡萄球菌的抑制最低；复合物金银花+蒲公英+益母草+连翘、连翘+蒲公英对大肠杆菌具有一定的抑制效果，而其他复合物对其抑制效果相对不明显。从以上结果分析可得，对两种主要病原微生物抑制效果较好的复合物中都存在蒲公英。研究报道，蒲公英具有抗病毒、抗肿瘤、降血脂等功能，特别是抗菌和抗炎作用[9]。金银花性寒具有清热解毒、抗炎抑菌以及治疗猩热等作用。连翘中的连翘苷脂和连翘酚对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制作用[10]。因此，理论上将以上几种植物水提物作为抑制奶牛乳房炎病原微生物的首选药物。孟静思等[11]研究发现，蒲公英对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都具有一定的抑制作用，这与本试验研究结果一致。曹文斌等[12]研究表明，具有清热解毒类的连翘、金银花、蒲公英的复合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有一定的抑制效果。霍佳楠[13]研究得出，蒲公英提取物可以有效的抑制金黄色葡萄球菌的生长，并且能降低生物膜的形成和促进成熟生物膜的消除进一步减少耐药性的产生。此外，蒲公英还可以减少促炎因子的表达抑制核转录因子(NF)-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1β，以及减少诱导型一氧化氮合酶/一氧化氮(iNOS/NO)和环氧合酶2/前列腺素E2(COX)的表达和产生，进一步抑制奶牛乳房炎的发生[14-16]。国内外很多学者关于植物水提物的抑菌作用做了大量研究但是结果不尽相同，可能是由于植物水提物的提取工艺不同，操作者熟练程度不同，以及采用不同的药敏试验方法，但是总体的敏感性区间大致相同，能够为植物水提物治疗和预防奶牛乳房炎提供一定的参考价值。

3.2 二倍稀释法测定MIC和MBC值

采用二倍稀释法测定复合植物水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC 和MBC 值，可以较为直观和准确的判断出不同的复合物对其的敏感性。试验结果显示，复合物金银花+蒲公英+益母草+连翘对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对明显，MBC 值为3.91 mg/ml，复合物金银花+连翘+益母草、金银花+连翘+蒲公英、蒲公英+金银花+益母草、金银花+蒲公英对金黄色葡萄球菌的抑制效果次之，MBC 值均为7.81 mg/ml，复合物连翘+益母草、蒲公英+益母草对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较弱，MBC 值均为125 mg/ml；复合物连翘+益母草+蒲公英、连翘+蒲公英、金银花+蒲公英+益母草+连翘对大肠杆菌的抑制效果相对较为明显，MBC值均为125 mg/ml，复合物金银花+连翘+益母草、金银花+连翘+蒲公英、金银花+益母草对大肠杆菌对的抑制不明显，MBC 值均大于500 mg/ml。根据以上结果分析可知，复合植物水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌，可能是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞结构不同，药物的穿透力存在差异性导致抑制效果出现明显的区别。此外，研究结果表明含有蒲公英和金银花的复合物抑菌效果较为明显，可能是由于二者本身富含有丰富的黄酮类、精油、生物碱、有机酸等活性成分可以很好地发挥抑菌作用；但是也存在金银花与蒲公英和其他植物水提物同时存在的情况下抑菌效果出现降低的情况，可能是由于不同植物水提物混合之后发生相互作用，导致活性成分的功效下降，不能有效的发挥抑菌作用。本试验采用牛津杯和二倍稀释法两种方法测定复合植物水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果，结果有相似性但也存在一定的差异性，可能是由于牛津杯中药物不能完全渗透于培养基中，不能很好的起到抑菌作用；而二倍稀释法可以很好的将复合植物水提物与培养液以及菌液大面积接触，使药物能够充分的发挥其药效，因此出现较为明显的抑菌效果。

4 结论

不同的复合植物水提物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果存在差异性，其中含有蒲公英或金银花的复合物抑菌效果较为明显；11种复合植物水提物中金银花+蒲公英+益母草+连翘的抑菌效果最好；复合植物水提物对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对于大肠杆菌更为明显。