酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆幼鱼生长性能、体营养成分、消化及生理代谢指标的影响

■张 宇 高佳朋 韩和平 夏 辉 李雪鹤 荆冰妍 吴 彦 郭 冉*

（1.河北农业大学海洋学院，河北秦皇岛066003；2.河北省秦皇岛广播电视大学，河北秦皇岛066000；3.河北省海洋生物资源与环境重点实验室，河北秦皇岛066003）

大菱鲆（Scophthalmus maximusL.）自1992年引入我国后，养殖规模逐年扩大，近十年年平均产量可达5.7万吨，是我国北方主要的海水养殖鱼类之一[1]。大菱鲆是肉食性鱼类，以工厂化养殖模式为主，对配合饲料的蛋白质要求较高[2-3]，主要以鱼粉作为蛋白源[4]。我国面对饲料行业对于鱼粉需求的紧迫压力，寻找新的蛋白源替代鱼粉是养殖业和饲料企业的重大需求[5]。

羽毛粉水解肽一直存在着氨基酸不平衡，角蛋白和硬质蛋白不易吸收的问题，本试验所用酶解肽为利用生物酶技术将羽毛粉和血粉混合酶解后的功能性混合肽，具有氨基酸较平衡，吸收率高等优点。小肽作为蛋白质降解过程中的中间产物，具有吸收速度快，耗能低和其他营养物质吸收过程无竞争等优点，而且生产成本较低，蛋白质含量较高，可以作为鱼粉替代中的一种蛋白源[6]。姚清华等[7]研究表明羽毛粉类小肽产品较为适合作为大黄鱼饲料蛋白源，其次依次为日本鳗鲡、凡纳滨对虾、杂色鲍的饲料蛋白源。施用晖等[8]研究表明，在产蛋鸡日粮中添加小肽制品后，其产蛋率和饲料转化率有明显的提高，鸡蛋壳的硬度也有提高的趋势。目前发现小肽制品只能低比例替代鱼粉，如何提高小肽制品在作为新型蛋白源替代水产动物配合饲料中鱼粉是值得思考的问题，我们前期研究表明酶解肽制品替代大菱鲆配合饲料中鱼粉比例超过8%时，会降低其生长性能，超过16%时会严重影响大菱鲆的脂肪吸收代谢机能[9]，因此我们推测高比例替代鱼粉组大菱鲆体内的胆汁酸合成代谢可能受到影响。

胆汁酸是一种在肝脏中由胆固醇合成的两性甾醇类化合物[10-11]，是胆汁中的重要成分。胆汁酸能够促进脂质的消化代谢，在调节机体脂肪的消化代谢过程中起着不可或缺的作用[12]。因此，本试验以大菱鲆为研究对象，在不同比例酶解肽替代鱼粉条件下补充胆汁酸，研究其对大菱鲆生长性能、消化代谢和脂肪累积的影响。

1 材料与方法

1.1 试验原料与试验配方

酶解肽来自秦皇岛益尔生物科技有限公司，主要营养成分见表1，胆汁酸（分析纯）购买自麦克林试剂有限公司。饲料所有原料经粉碎后过60 目筛并按照配方中比例逐级混匀再加入大约20%纯水搅拌均匀，用膨化饲料机（江门市江晟电机厂有限公司Y80MT-2）制成直径大约1.5 mm 的颗粒状饲料，自然晾干12 h 后（饲料水分2%），将其放于-20 ℃冰箱中备用。试验配方和主要营养水平见表2。

表1 酶解肽主要营养水平（干物质基础，%）

表2 试验饲料组成和营养水平(干物质基础)

1.2 试验设计及饲养管理

全鱼粉组作为基础饲料D0，其他四组分别为等比例替代鱼粉7% D1、14% D2、7%加胆汁酸组D3、14%加胆汁酸组D4。胆汁酸添加量为0.05%，以三氧化二钇作为指标物。试验用大菱鲆鱼来自营口文慧生物饲料有限公司，养殖试验在河北农业大学海洋学院水产经济动物增养殖重点实验室进行。养殖用水族箱（40 cm×50 cm×60 cm）为室内水族箱，先将大菱鲆鱼在水族箱内暂养两周，投喂商业饲料（蛋白≥50%，脂肪≥10%）。然后随机挑选大小均匀，体质健壮初始体质量为(12.15±0.03) g的大菱鲆鱼450条，每组三个重复，每个重复为一个水族箱放30 尾鱼。养殖用水为自然海水，盐度为(30±1)‰，经过紫外消毒、沉淀、砂滤的过程进入养殖系统，养殖系统为室内流水系统，整个养殖期间24 h供氧，每天12 h日光灯照射，每天早8:00 和晚8:00 饱食投喂两次，每天喂食1 h 后吸出剩余残饵和粪便，用于计算饲料系数。每天换水量为整个系统的1/3～1/2。试验过程中每天测定水温，记录天气及进食情况，每两周进行一次溶氧、pH值、氨氮、亚硝酸盐的检测。试验周期为8 周。养殖全程水温（17±1）℃，溶氧含量（8±0.3）mg/l，pH值在8.0～8.6，氨氮（0.49±0.12）mg/l。

1.3 样品采集

试验开始4 周后开始收集粪便，每次投喂饲料1 h后先排出残饵然后再用吸管吸出新鲜、饱满、成型的粪便，放入-80 ℃冰箱中用于消化率的检测。试验结束后，将大菱鲆空腹24 h，拭干大菱鲆体表水分后称量每个水族箱中大菱鲆总重、并计数，用于计算大菱鲆生长指标中的存活率、增重率和特定生长率。每个水族箱随机选出3 条鱼用MS222 麻醉后用于体成分分析。另取5 尾鱼麻醉后量其体长、体重，用于计算肥满度等指标，然后用1 ml 一次性注射器（肝素钠润洗）从尾静脉抽血，放置4 ℃冰箱冷藏室过夜后在4 ℃、3 500 r/min 离心10 min，取上清液用于血浆生化指标（葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、总胆汁酸）和理化指标的检测。摘取肝脏用生理盐水漂洗后用滤纸拭干水分后称重，经研磨后4 ℃、2 500 r/min 离心10 min取上清液用于消化代谢指标的检测。最后刮取大菱鲆背部肌肉用于背肌蛋白、脂肪和灰分的检测。

1.4 指标测定方法

1.4.1 生长和体成分指标

鱼体和饲料常规成分分析参照AOAC 法[13]。饲料及粪便中三氧化二钇的含量通过电感耦合等离子体质谱仪（美国thermo公司iCAPQ）检出。

1.4.2 消化代谢酶指标

肝脏中脂肪酶（LPS）采用比浊法、胃蛋白酶（PPS）采用紫外分光光度法；肝脏和血浆中谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）采用赖氏法。血浆中葡萄糖（GLU）含量采用DNS 比色法测定，总胆固醇（TCHO）含量采用氧化酶法测定，甘油三酯（TG）含量采用甘油氧化酶法测定，总胆汁酸（TBA）含量采用循环酶速率法，组织中蛋白质含量采用考马斯亮兰法测定。各种酶指标和组织中蛋白质含量检测均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，血浆生化指标送秦皇岛海港医院检测。

1.5 数据分析

试验得出所有数据均使用SPASS17.0 分析软件分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，结果表示为“平均值±标准差（Mean±SD.）”，若组间有显著性差异，再使用Duncan's 法进行多重比较分析，显著性水平为P＜0.05。

2 试验结果

2.1 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆生长性能的影响（见表3）

表3 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆生长性能的影响

由表3可知，各试验组增重率与对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。各组间饲料系数、成活率、肝体比无显著性差异（P＞0.05）；各试验组肥满度均高于对照组，且D4显著高于对照组（P＜0.05）。

2.2 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆组织成分的影响（见表4）

表4 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆体成分的影响（干物质基础，%）

由表4 可知，各组全鱼粗蛋白、水分和背肌灰分无显著差异（P＞0.05），D3、D4组全鱼粗脂肪含量显著高于D0、D1、D2组（P＜0.05）；D1、D3组背肌粗蛋白含量显著高于其他组（P＜0.05），D3、D4组背肌粗脂肪含量分别显著高于D1、D2组（P＜0.05）；D3、D4组肝脏粗脂肪含量分别显著低于D1、D2组。

2.3 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆表观消化率的影响（见表5）

表5 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆粗蛋白、粗脂肪和干物质表观消化率的影响(%)

由表5可知，D3、D4组蛋白质、脂肪和干物质的表观消化率分别显著高于D1、D2组（P＜0.05）且对照组显著高于D1、D2组（P＜0.05）；D4组粗蛋白表观消化率显著高于D2组（P＜0.05）。

2.4 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆血浆中GLU、TCHO、TG和TBA的影响（见表6）

由表6可知，D3、D4组GLU、TCHO、TG含量分别显著低于D1、D2组(P＜0.05)，各组TBA含量无显著性差异(P＞0.05)。

2.5 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆肝脏脂肪酶和胃蛋白酶的影响（见表7）

由表7 可知，肝脏中D3、D4组脂肪酶活性与D0组无显著性差异（P＞0.05），但D3组高于D1组（P＞0.05），D4组显著高于D2组（P＜0.05），胃蛋白酶活性D3组显著高于D1组，且D4组显著高于D2组（P＜0.05）。

2.6 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆肝脏GOT、GPT的影响（见表8）

由表8可知，血浆中GOT和肝脏中GPT含量D3组显著低于D1组，D4组显著低于D2组（P＜0.05），对照组显著低于D1、D2组（P＜0.05）；血浆中GPT中含量D3组低于D1组，D4组低于D2组，但差异不显著（P＞0.05）；肝脏中GOT含量D3组低于D1组，D4组显著低于D2组（P＜0.05）。

表6 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆血浆GLU、TCHO、TG和TBA的影响

表7 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆肝脏脂肪酶和胃蛋白酶指标的影响

表8 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆肝脏GOT、GPT指标的影响

3 讨论

3.1 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆生长、组织成分以及粗蛋白、粗脂肪和干物质表观消化率的影响

在饲料中添加适量酶解肽对异育银鲫生长和鱼体成分无显著影响[14]，还能降低其饲料成本。酶解肽在凡纳滨对虾饲料中替代鱼粉比例过高时，会显著降低全虾粗脂肪含量[15]。孙建珍等[16]发现大菱鲆饲料中添加胆汁酸能够提高其增重率，促进其对脂肪的消化吸收，显著提高脂肪酶的活力。谭永刚等[17]、张玲等[18]、胡田恩等[19]在异育银鲫、鲤鱼、牛蛙上的研究均表明在饲料中添加胆汁酸能够提高机体的生长性能、增重率和饲料利用率。以上研究结果与本试验结果一致。由肝脏粗脂肪含量、脂肪酶活性和粗脂肪的表观消化率结果推测酶解肽替代鱼粉比例过高时会导致肝脏脂肪增加而影响鱼体内胆汁酸的合成，进而影响鱼体对脂肪的吸收利用，最后导致背肌脂肪沉积率显著降低。添加胆汁酸两组全鱼、背肌粗脂肪含量显著高于试验组中未添加胆汁酸组，且肝脏脂肪低于未添加组（P＜0.05）。加入胆汁酸后提高了饲料脂肪利用率和饲料蛋白质沉积率，增加了鱼体背肌蛋白和脂肪累积。有研究显示适量小肽添加到星斑川鲽幼鱼日粮中能够提高对蛋白质的吸收利用，蛋白质分解后的小肽可以直接被机体吸收利用，能够增加蛋白吸收速度，所以小肽在蛋白质代谢过程中有着不可或缺的作用[20-22]，也验证了本试验中低比例酶解肽替代鱼粉组背肌粗蛋白高于其他组的结果。但是鱼粉替代量过高时又会影响其生长的原因可能是酶解肽的替代量过高其本身存在的一些角蛋白不易吸收问题更加明显，正好跟本试验粗蛋白表观消化率结果相一致。

3.2 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆血浆GLU、TCHO、TG和TBA和肝脏胃蛋白酶、脂肪酶的影响

本试验结果显示添加酶解肽和胆汁酸组显著降低了血浆中GLU、TCHO、TG含量，且高比例肽加胆汁酸组肝脏中脂肪酶活性显著高于高比例肽未添加胆汁酸组。单添加酶解肽组TCHO、TG 含量高于对照组，可能由于酶解肽的替代导致大菱鲆鱼摄入的脂肪用于能量的消耗，脂肪分解后使血浆中TCHO、TG 含量升高，而鱼体肌肉脂肪累积下降，而加入胆汁酸组显著降低了血浆中TCHO、TG 含量，促进了脂肪在肌肉中的累积。由于鱼体可能将脂肪分解为脂肪酸用于肌肉的氧化供能从而减少了GLU的利用，使血浆中GLU的含量有所积累。有研究发现[23]，饲料中添加胆汁酸能够促进脂肪的乳化，活化脂肪酶，增强脂肪酶的活性。相同替代水平下添加酶解肽加胆汁酸组胃蛋白酶活性显著高于单添加酶解肽组，与试验结果粗蛋白表观消化率相一致，说明酶解肽替代鱼粉后加入胆汁酸有利于大菱鲆对蛋白质的消化吸收。

3.3 酶解肽替代部分鱼粉及补充胆汁酸对大菱鲆肝脏GOT、GPT的影响

GOT、GPT 为肝损伤程度的重要指标，GOT、GPT含量的不正常升高为肝损伤和肝炎发生的标志。张国安等[24]、黄炳山等[25]等研究表明，大菱鲆饲料中添加胆汁酸组血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量显著低于未添加胆汁酸组，与本试验结果相类似。说明酶解肽替代部分鱼粉后加入胆汁酸能有效降低血浆中GOT、GPT含量，起到保护肝脏的作用。

4 结论

在本试验条件下，酶解肽替代部分鱼粉后加入胆汁酸对大菱鲆生长性能、脂肪累积及消化代谢有一定的促进作用，因此酶解肽高比例替代鱼粉蛋白饲料加入胆汁酸效果较好。