生物技术在水产动物生物饲料研究中的应用进展

■翁俊杰 艾 蓉 傅玲琳 王彦波* 刘长军

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.浙江象山县水产技术推广站，浙江象山315700）

目前我国水产养殖正处于稳定发展的阶段，据报道，我国的水产养殖产量约占世界水产养殖总产量的70%[1]，且规模仍在不断扩大。然而，传统的水产养殖方式带来的水产动物安全隐患和养殖环境恶化引起了广泛的关注。此外，抗生素及其他化学药物在水产养殖中不合理使用和滥用引起的残留和耐药性现象，严重影响了消费者的食用安全，因此如何借助于新的技术手段，研究和开发新一代饲料和饲料添加剂成为研究的热点。近年来随着包括基因工程、酶工程、微生物工程等在内的生物技术的持续发展，水产动物生物饲料逐渐成为饲料行业和生物饲料产业的发展趋势之一，目前关联的水产动物饲用益生菌、抗菌肽、酶制剂、饲料酵母、微藻、单细胞蛋白等均已逐渐用于水产养殖且取得了显著的效果。随着全球饲料行业和水产养殖业的快速发展，蛋白资源的紧缺和环境保护的加强已成为制约相关行业发展的重要因素，依托现代生物技术并加快其在水产动物生物饲料研究中的应用具有重要的现实意义和理论价值。

1 基因工程

1.1 基因工程与饲用益生菌

研究表明，饲用益生菌可以通过改变与养殖动物相关的微生物群落，起到维护动物胃肠道微生物群的生态平衡、保护其正常生理功能的作用，从而达到改善饲料利用率、增强机体免疫力等目的，而且还能减少由抗菌药物引起的动物畸变和抗生素耐药性等问题。目前在水产养殖中应用较多的益生菌种类包括乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、嗜热链球菌等。近年来，随着基因工程技术的快速发展，逐渐应用到饲用益生菌中，通过构建工程菌的方法可以使之表达一些有用的外源基因，扩大其生物学功能，从而达到一种制剂发挥多种功能的目的，而且还能增强益生菌的稳定性。Santos 等[2]通过基因融合手段在枯草芽孢杆菌中成功表达了烟曲霉菌的植酸酶基因，构建后的菌株不仅明显减弱了植酸在斑马鱼饮食中的抗营养作用，还促进了斑马鱼的生长。Lin 等[3]同样发现通过重组技术构建的益生菌可以改善斑马鱼的营养代谢和肝脏氧化应激反应，且对嗜水气单胞菌和无乳链球菌的抵抗力也得到显著增强。研究表明，饲料中添加能表达木聚糖酶基因的重组解淀粉芽孢杆菌R8，饲喂尼罗罗非鱼60 d 后发现鱼体内与碳水化合物代谢相关的酶基因以及肝脏中的胰岛素样生长因子-1（Insulin like Growth Factor, IGF-1）基因的表达水平显著升高，提高了饲料利用率和对嗜水气单胞菌的抵抗力[4]。基因工程应用于饲用益生菌的安全性也引起了关注，Zhao 等[5]利用基因克隆技术从凝结芽孢杆菌中克隆了新型α-半乳糖苷酶，经过蛋白质活性和抗性分析，在揭示其显著的蛋白酶抗性和高水解活性基础上，进一步研究证实了饲用安全性。

1.2 基因工程与饲用抗菌肽

由于抗菌肽在体内的表达水平较低，且提取和纯化既困难又昂贵，所以目前商业上的饲用抗菌肽主要是通过基因工程技术生产。近年来随着技术的不断进步，泥鳅、河豚、鲈鱼、青蟹等水产动物抗菌肽基因被克隆，为饲用抗菌肽的研发奠定了基础。研究发现，在饲料中添加饲用抗菌肽可以显著改善水产养殖动物的免疫力和对疾病的抵抗力，最终促进动物生长发育，He等[6]利用基因工程成功在小球藻中表达了重组抗菌肽Scy-hepc，体外和体内的结果表明饲喂表达了抗菌肽的小球藻可显著增强鲤鱼对嗜水气单胞菌的抵抗力。进一步研究揭示不同的饲用抗菌肽抗菌机制有所不同。迄今研究证明饲用抗菌肽主要通过两种途径起作用，一种是抗菌肽与病原微生物细胞膜上的特定受体结合使膜的通透性发生改变，从而改变细胞内外渗透压，使细胞内容物外流导致细胞死亡；另一种是抗菌肽直接穿过细胞膜在细胞中发挥作用，抑制细胞的生物学活动，例如抑制细胞内酶活性、阻断DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译等。由此可见，抗菌肽与细胞膜的相互作用对于抗菌肽的功效至关重要，综析国内外的研究报道，目前主要存在三种肽-膜互作模型（图1）。桶板模型（Barrel-stave）通过抗菌肽先在膜表面聚集，再以多聚体的形式插入膜双分子层中，形成一个跨膜离子通道使细胞质外流导致细胞死亡；环孔模型（Toroidal）则是通过抗菌肽插入膜中，借助于抗菌肽疏水端可以使膜疏水中心形成裂口，引起膜向内弯曲形成一个直径为1～2 nm 的环孔；第三种地毯模型（Carpet-like）是一种膜渗透模型，肽不是插入膜中而是在膜表面积聚，形成一个“地毯”覆盖在膜表面，以“去垢剂”的作用方式破坏细胞膜而引起细胞死亡[7]。此外，研究人员也提出了一些其他肽-膜互作模型，如聚集体模型、分子电穿孔和“筏沉没”模型等，这些对理解抗菌肽的抗菌机制也是重要的[7]。随着对水产动物各种抗菌肽结构和功能研究的深入，通过基因工程构建新型的饲用抗菌肽成为未来研究的趋势，如从河豚的皮肤黏液中提取纯化并克隆了新型抗菌肽TpHAMP2，分析表明[8]该重组肽与天然肽具有相同的抗菌活性，这为饲用抗菌肽的商业化提供了可能。

图1 抗菌肽作用机制模型

2 酶工程

2.1 酶工程与饲用效果

饲用酶制剂作为酶工程在饲料行业的应用取得了显著的效果，涉及饲用植酸酶、木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶等，近五年酶制剂在水产动物饲料中的研究参见表1。在水产饲料中添加适量的酶制剂可促进养殖动物对营养的吸收以改善生长性能。Li 等[9]发现在饲料中添加175 mg/kg 蛋白酶可明显提高饲料干物质和蛋白质的表观消化率，且改善了生长性能，此发现在罗非鱼、虹鳟鱼和长鳍鲤中均有类似报道。有些植物性饲料原料中含有多种抗营养因子，因此需要对酶进行复配以弥补单一酶改善抗营养因子的不足。杨航等[10]用由植酸酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶组成的复合酶制剂，有效降解了饲料中的植酸、果胶质、β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖等抗营养因子，提高了草鱼对蛋白质、磷和干物质的利用率。此外，酶制剂在饲料配伍加工过程中的作用时间以及与饲料中其他添加剂的相互作用也引起了关注。研究发现，在饲料制粒和熟化过程中蛋白酶就已经发挥了水解蛋白质的作用，该蛋白酶经过制粒和熟化过程后活性依然可保留79.3%和67.5%[9]。Zhu等[11]发现饲料中的柠檬酸可为植酸酶提供适宜的酸性环境来提高黄鲶鱼对磷的利用率。Yao等[12]发现在饲料中添加蛋白酶、糖酶和有机酸盐可显著提高太平洋白虾的生长性能和饲料利用率，且三种添加剂的组合使用比单独添加具有更显著的效果。这为科学合理地设计包含饲用酶制剂在内的生物饲料配方和配套生产工艺提供了理论依据。

表1 酶制剂在水产动物饲料中的应用研究

2.2 酶工程与饲用机制

基于酶工程技术的酶制剂在水产动物生物饲料中取得了显著的应用效果，这与酶制剂的生理活性具有显著的关联。酶制剂的饲用机制主要包括以下几个方面：一是降解植物性饲料中的抗营养因子，改善水产动物对饲料营养物质的消化、吸收和利用。研究发现添加植酸酶和蛋白酶可消除鱼饲料中植酸、蛋白酶抑制剂和植物凝集素的抗营养作用，显著提高尼罗罗非鱼对蛋白质、磷、矿物质和脂质的利用率[20]。Castillo等[21]的研究也证实了这一点。二是改善肠道结构和调节肠道菌群。Adeoye等[22]发现用复合酶制剂（植酸酶、蛋白酶和木聚糖酶）饲喂罗非鱼可增加肠道微绒毛密度，且饲用前后肠道中变形杆菌和放线菌的菌落特征发生改变。在草鱼的研究中也得到了类似的研究结果[10]。三是调节养殖水产动物的免疫能力。据报道，菠萝蛋白酶可以调节T细胞和B细胞的免疫应答、一氧化氮介导干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，而在木瓜蛋白酶上存在的酶促和非酶促位点都可以激活T 淋巴细胞和先天免疫反应[24]。Choi等[19]发现在饲料中添加混合蛋白酶喂养草鱼后，其体内相关免疫基因表达显著增加，免疫力得到显著改善。

3 微生物工程

3.1 微生物工程与饲用单细胞蛋白

单细胞蛋白（single cell protein, SCP）又称为微生物蛋白。随着蛋白资源紧张在现代饲料工业领域引起广泛关注，饲用酵母、细菌等SCP 均已逐渐应用于水产饲料中且取得显著效果。其中细菌SCP 中蛋白含量可高达80%且易于培养，因此被认为是最合适的SCP 生产来源。细菌主要是以碳氢化合物或甲醇作为底物进行发酵生产SCP，因此原料来源非常广泛，一般的食品加工废弃物和副产物等均能作为底物来综合利用，这很大程度上减少了饲料的生产成本。目前SCP生产以固态发酵和液体深层发酵为主，其原料和菌种的多样性使得在发酵生产过程中需要多种生物反应模式以适合发酵菌种的增长（表2）。目前用于SCP 生产的细菌主要包括双歧杆菌、乳酸菌、光合细菌、芽孢杆菌等，而一些新型的潜在菌种也在逐步研究中。现已在鱼类和虾类上成功测试了几种基于甲烷营养菌的SCP产品[25]。研究发现产氨棒杆菌SCP可以替代虾饲料中10%～20%的鱼粉[26]。Tlusty等[27]研究发现扭脱甲基杆菌SCP 可替代鲑鱼饲料中55%的鱼粉，在鳟鱼饲料中可以替代鱼粉10%[28]，而在虾饲料中能够完全替代鱼粉[27]。此外借助于微生物工程技术的进步，菌种发酵方式逐步由单一菌种趋向于复合菌株的协同发酵，通过不同菌种间的协同互补可生产产量更高、营养成分更齐全的SCP。孙立瑞等[29]发现在甲烷氧化菌培养中加入光合菌能够明显促进甲烷氧化菌生长，且缩短了发酵周期，显著提高了SCP 产量。Chumpol 等[30]在南美白对虾饲料中添加了1%的两种紫色非硫细菌SCP 混合物，虾的生长性能、免疫力和存活率均得到显著提高，且显著优于单一SCP。细菌和微藻的SCP 混合物在斑节对虾上的研究结果同样表明，SCP可安全替代虾饲料中的鱼粉和鱼油[31]，且当饲料中添加10%SCP 混合蛋白时就能够加快生长速度[32]。

表2 不同反应模式和微生物种类的比较优势[25]

3.2 微生物工程与饲用微藻

同样，借助于微生物工程的饲用微藻也已成功用于水产动物生物饲料中，涉及小球藻、螺旋藻、节旋藻等藻类。研究表明，饲用微藻通过富含的生物活性分子而发挥其生物学作用。如饲用微藻中富含的不饱和脂肪酸可有效改善养殖动物体内的脂肪酸谱[33]；饲用小球藻中的β-葡聚糖对鱼类具有明显的抗有害菌活性和免疫刺激活性；部分饲用微藻中的类胡萝卜素可以保护细胞免受自由基侵害，防止脂质过氧化和维持重要免疫细胞、组织的结构完整性，并促进生长发育和提高存活率[33]；饲用微藻中虾青素的抗氧化、抗高血脂作用可显著改善鱼虾的健康状况[34]，在以克氏原螯虾[35]和金鲳鱼[36]为研究对象的实验中均得到了验证。

此外，结合基因工程和微生物工程各自的优势，已逐步应用于莱茵衣藻等饲用微藻开发中[33]，旨在增强饲用微藻的生物学作用，改善水产动物的免疫力、抗病性。已有研究证明，通过生物技术改良后可生产牛乳铁蛋白抗菌肽的饲用微藻，可以显著增加养殖鱼体内多不饱和脂肪酸和抗体含量，使鱼体对细菌性肾脏疾病的免疫力得到增强[37]。近五年国内外对饲用微藻种类及其在水产动物中的应用研究参见表3。

表3 饲用微藻种类及其在水产动物中的应用

4 展望

基因工程、酶工程、微生物工程等生物技术的应用，为水产动物生物饲料的开发提供了新的思路。目前饲用益生菌、抗菌肽、酶制剂、微藻等都已应用于实际水产养殖生产中，但是由于相关作用机理还尚未完全研究清楚，尤其是缺乏在分子和细胞层面的深入研究，这很大程度上限制了在可持续水产养殖业中的靶向针对性应用。剖析国内外的相关研究，学科交叉下生物饲料与水产动物互作机制的深入探究、微生境下各种益生因子关联网络的构建、迅速发展的生物技术背景下可利用资源的拓展等已经逐渐成为本领域未来发展的趋势，可为水产动物生物饲料的研发奠定坚实的基础，为水产品安全生产和水产养殖环境保护提供必要的保障。