松针精油对青贮饲料中主要微生物的影响

■孙建政 王晓娜 孙国君 沈思军

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000）

微生物在青贮饲料发酵过程中有着重要作用，其动态繁殖规律会直接影响青贮饲料的发酵品质。参与青贮过程的微生物种类很多，包括有利于青贮饲料发酵的有益微生物以及引起青贮腐败变质的有害微生物[1]。乳酸菌是青贮发酵过程中最主要的有益微生物，它的大量繁殖能使青贮饲料稳定发酵，改善饲料的发酵品质。酵母菌、霉菌和梭状芽孢杆菌等是青贮发酵过程中的主要有害微生物。酵母菌被认为是青贮初期变质最重要的微生物，它能使pH升高，降低饲料的营养和发酵品质，甚至产生毒素[2]。梭状芽孢杆菌属于青贮饲料的腐败细菌，它们主要分解青贮饲料中的蛋白质和氨基酸，使青贮饲料腐烂变质，产生臭味[3]。霉菌通过呼吸作用将纤维素和其他细胞壁组分分解产生有毒物质，降低青贮饲料的营养价值。目前通常在青贮饲料中添加甲酸、乙酸和丙酸等化学发酵抑制剂，抑制青贮发酵过程中有害微生物的活动，提高青贮饲料质量[4]。该法与常规青贮法相比，虽然饲料营养物质减少损失50%～67%，但制作成本和技术要求较高，并且液体有机酸具有腐蚀性，在生产中存在安全隐患，与实际生产差距较大。因此，如何有效缓解饲料青贮时营养价值的降低幅度，探索出生产高品质青贮饲料的新方法，一直是当前国内外学者关注和研究的热点问题。

植物精油具有显著的抑菌活性和广谱抗菌作用，与化学抑菌剂相比副作用小、残留毒性低，已成为当前新型天然抑菌剂的研究热点[5]。杨昭等[6]研究发现，牛羊饲料中添加牛至精油，能够抑制多种有害菌（霉菌、大肠杆菌和好氧细菌）的生长繁殖，延长饲料的保存期限。余行等[7]研究发现，山苍子精油、肉桂精油和生姜精油对霉菌均有一定的抑制作用，延长颗粒饲料的保存期。松针精油是松针中的一种主要活性成分，具有良好的抑菌作用[8-10]。松针精油作为天然防腐剂，目前研究主要集中在食品防腐方面，对青贮饲料中微生物抑制效果的研究尚未见报道。因此，本试验旨在研究松针精油对青贮饲料中主要微生物的抑制效果，为松针精油在青贮饲料抑菌方面的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

松针精油：以樟子松松针为原料，采用水蒸气蒸馏法提取精油。

菌种：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilusCICC6075）、酵 母 菌（Saccharomyces cerevisiaeCICC1810）、梭 状 芽 孢 杆 菌（Bacillus fusiformisCICC10067）、串 珠 镰 刀 菌（Fusarium moniliformeCICC2490）均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液的制备

以嗜酸乳杆菌、梭状芽孢杆菌、酵母菌、串珠镰刀菌为供试菌种。将梭状芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基，于30 ℃恒温培养箱内培养24 h；嗜酸乳杆菌采用MRS肉汤，于37 ℃恒温培养箱内培养48 h；串珠镰刀菌采用察氏培养基，酵母菌采用马铃薯葡萄糖液体培养基，于28 ℃恒温培养箱内培养48 h。取部分菌液用生理盐水稀释成105～106CFU/ml 菌株悬浮液，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 最低抑菌浓度（MIC）测定

采用微量肉汤稀释法[11]。采用二倍稀释法将松针精油用DMSO溶剂稀释成系列浓度(0.064～65.8 mg/ml)，在96孔板上每孔各加入100 μl营养肉汤和20 μl菌液浓度为106CFU/ml的菌液。另外，对照组每孔加入DMSO溶液100 μl，试验组每孔加入100 μl松针精油。在摇床中培养16 h，取20 μl菌液涂布于平板上，每个处理重复3次，结果以无菌生长的最低精油浓度为MIC值。

1.2.3 抑菌活性测定

采用滤纸片法测定。用无菌棉签蘸取105CFU/ml的菌悬液，在营养琼脂平板表面均匀涂抹3 次，室温干燥5 min。将滤纸片(直径6.0 mm)平放于无菌平板内，精油组滴加不同浓度精油20 μl，并以DMSO作为对照，室温自然晾干，用无菌镊子取样片贴放于平板表面，每个处理重复3 次。培养24 h，以十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.4 松针精油对供试菌种生长曲线的影响

将供试菌种培养至对数生长期，取出部分菌液，分为对照组和松针精油组，对照组将菌液直接用相应的液体培养基稀释到菌体个数为105～106CFU/ml；精油组将菌液加到含精油浓度为最低抑菌浓度的液体培养基中，继续培养。分别在0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、48 h 取样测活菌数，制作出对照组生长曲线和精油组生长曲线。

2 结果

2.1 松针精油对供试菌种的最低抑菌浓度

以青贮饲料中的有益微生物（嗜酸乳杆菌）和有害微生物（酵母菌、梭状芽孢杆菌以及串珠镰刀菌）为供试菌种，测定松针精油对四种菌种的最低抑菌浓度，其试验结果见表1。由表1可知，对照组平板上均有大量菌落生长，说明DMSO对四种微生物没有抑制作用；在一定浓度范围内，精油组除嗜酸乳杆菌外，其他三种微生物在平板上都会被抑制。说明松针精油对酵母菌、梭状芽孢杆菌以及串珠镰刀菌都有一定的抑制作用。松针精油对串珠镰刀菌的抑制作用最强，其MIC值为4.112 5 mg/ml；其次是对酵母菌的MIC值为8.225 0 mg/ml；对梭状芽孢杆菌的抑制作用仅次于酵母菌，其MIC值为16.450 0 mg/ml；而对嗜酸乳杆菌几乎起不到抑制作用。由此可见，松针精油对青贮饲料中四种菌种的抑制效果存在着一定的差异，强弱顺序依次为：串珠镰刀菌＞酵母菌＞梭状芽孢杆菌＞嗜酸乳杆菌（无抑制效果）。

表1 松针精油对供试菌种的最低抑菌浓度

2.2 松针精油对供试菌种的抑菌活性

从表2中可以看出，滤纸片中加入DMSO后，串珠镰刀菌、酵母菌、梭状芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌平板上均没有出现抑菌圈，说明DMSO 对它们没有抑制作用。当滤纸片中加入不同浓度的松针精油后，在一定浓度范围内，串珠镰刀菌、酵母菌和梭状芽孢杆菌平板上均出现不同大小的抑菌圈，并且随着精油浓度的增加，抑菌圈直径逐渐增大。其中松针精油对串珠镰刀菌的抑菌效果最为显著，最大浓度抑菌圈直径达到15.52 mm，属于中度敏感；酵母菌对松针精油的敏感度也属于中度敏感，最大浓度抑菌圈直径为12.46 mm；梭状芽孢杆菌对松针精油的敏感度为低度敏感，其最大浓度抑菌圈直径仅为9.46 mm；而嗜酸乳杆菌对松针精油完全不敏感，没有出现抑菌圈。说明松针精油对串珠镰刀菌、酵母菌和梭状芽孢杆菌都表现出抑制作用，对嗜酸乳杆菌没有抑制作用。综上所述，松针精油对青贮饲料中主要微生物的抑制效果存在较大差异，对青贮有益微生物没有抑制效果，而对青贮主要有害微生物有着较强的抑制作用，其抑菌活性大小依次为：串珠镰刀菌＞酵母菌＞梭状芽孢杆菌＞嗜酸乳杆菌（无抑制作用），这一结果与最低抑菌浓度试验结果相吻合。

表2 松针精油对供试菌种的抑菌活性

2.3 松针精油对供试菌种生长曲线的影响

图1 松针精油对嗜酸乳杆菌生长曲线的影响

由图1可知，对照组嗜酸乳杆菌的生长曲线完全符合“S”型生长曲线，有明显的迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。在0～4 h 处于迟缓期，4 h～16 h 进入对数生长期，16～24 h进入稳定期，从24 h之后进入衰亡期，最大活菌数为1.08×109CFU/ml。加入松针精油之后，嗜酸乳杆菌的迟缓期仍为0～4 h，而对数生长期延长至20 h，并且最大活菌数较对照组增加27.36%。可见，松针精油对嗜酸乳杆菌并没有起到抑制效果，反而起到了一定的促进作用，延长了对数生长期，导致菌体数量达到了一个新的峰值，并且延缓了衰亡期的到来。

图2 松针精油对酵母菌生长曲线的影响

由图2可知，对照组酵母菌的生长曲线符合微生物正常的生长规律，有明显的迟缓期、对数期、稳定期以及衰亡期。在0 h～8 h处于迟缓期，8 h以后进入对数生长期，24 h 以后进入稳定期，32 h 以后进入衰亡期，最大活菌数为6.7×108CFU/ml。加入松针精油之后，酵母菌的迟缓期被延长，延长至16 h，16 h以后进入短暂的对数生长期，而且对数生长期的菌体数量没有达到正常的峰值，其最大活菌数较对照组降低56.72%，并经过短暂的稳定期，迅速进入衰亡期。因此，可以看出，松针精油对酵母菌有着较强的抑制作用，破坏了酵母菌的生长规律，迟缓期时间变长，较大幅度地降低了对数生长期菌体的生长峰值。

图3 松针精油对串珠镰刀菌生长曲线的影响

由图3可知，对照组串珠镰刀菌在0～16 h处于生长迟缓期，16～36 h 处于对数生长期，36～48 h 处于稳定期，最大活菌数为2.5×109CFU/ml。在加入松针精油后，串珠镰刀菌生长迟缓期延长到24 h，对数生长期缩短到32 h，并且菌体数量的峰值较对照组菌体降低39.68%。由以上分析可看出，松针精油对串珠镰刀菌的生长有着极为明显的抑制效果，能较长时间的抑制串珠镰刀菌的生长，缩短了对数生长期菌种的生长时间，大幅度降低最大活菌数。

图4 松针精油对梭状芽孢杆菌生长曲线的影响

由图4可知，对照组梭状芽孢杆菌的生长曲线符合“S”型生长曲线，在0 h～8 h 处于迟缓期，8 h～24 h处于对数生长期，24 h～32 h 处于稳定期，32 h～48 h处于衰亡期，最大活菌数为8.8×108CFU/ml。加入松针精油后，迟缓期延长到12 h，对数生长期缩短，最大活菌数较对照组菌体降低61.14%，并且经过短暂的稳定期，迅速进入衰亡期。可见，松针精油对梭状芽孢杆菌有一定的抑制作用。

3 讨论

MIC 值是评价植物精油抑菌效果的一个重要指标，同时抑菌圈直径的大小也能反映出植物精油抑菌能力的高低[13-14]。本试验结果显示，松针精油对嗜酸乳杆菌没有抑制作用，这与曾维才等[15]、王改琴等[16]和Park等[17]研究结果基本一致。由此可见，乳酸杆菌的确对植物精油的敏感性较弱，甚至某些植物精油对乳酸杆菌没有抑制作用。本试验中松针精油之所以对乳酸菌没有抑制作用，其原因一方面可能与松针精油的化学成分和浓度有关，另一方面可能与乳酸菌中的活性抑菌成分乳酸菌素有关，它能对乳酸菌起到一定的保护作用，并且具有一定的稳定性。然而，松针精油对梭状芽孢杆菌、酵母菌和串珠镰刀菌有着较强的抑制作用，其最低抑菌浓度分别为16.450 0、8.225 0、4.112 5 mg/ml，最大浓度的抑菌圈直径分别为9.46、12.46 mm和15.52 mm，这与Zeng等[18]、Mo等[19]和董小英等[20]研究结果存在一定差异。其原因可能与植物精油的品种、化学成分以及试验方法有关。

生长曲线法可通过微生物的生长曲线反映群体的生长规律，揭示药物的抑菌效力，并从中判断药物对微生物产生的效果等各种信息[21]。本试验结果显示，对照组菌体的生长曲线符合“S”型生长曲线，遵循微生物正常的生长规律。而添加松针精油之后，酵母菌、梭状芽孢杆菌以及串珠镰刀菌的生长受到抑制，迟缓期延长，对数生长期缩短，并且最大活菌数较对照组有较大幅度的下降。这与孟霞霞[22]的试验结果一致。其主要原因可能是在迟缓期，微生物对抑菌剂高度敏感，松针精油的抑菌效果最强，从而使这三种微生物的迟缓期延长；随着时间的延长，由于精油的高度挥发性，导致精油抑制效果降低，因此这三种菌体可以进入对数生长期；然而松针精油可能破坏了某些菌体的结构，导致一些菌体发生了不可逆的改变，从而使对数生长期缩短，活菌数达不到正常的峰值[23]。然而松针精油对嗜酸乳杆菌的生长起到一定促进作用，对数生长期被延长以及最大活菌数有所升高，这与Kivnac 等[24]、Chaves 等[25]和 贾 彦 等[26]研 究 结 果 一致。其原因可能是松针精油中的有效成分为菌体的生长提供了促进因子，也可能是乳酸菌分泌的某些酶将松针精油中的某些物质分解成为自身可以利用的营养物质，从而促进菌体的生长[27]。

4 结论

松针精油作为一种天然植物提取物，具有良好的抑菌活性。体外抑菌试验表明，松针精油对青贮饲料中主要微生物的抑制效果存在较大的差异，对主要有害微生物有着较强的抑制作用，其抑制作用强弱顺序依次为：串珠镰刀菌＞酵母菌＞梭状芽孢杆菌，但对青贮有益菌（嗜酸乳杆菌）的生长可以起到一定的促进作用。