乳酸菌抗菌肽的纯化过程及其影响因素

◎ 刘 辉，张会生，童火艳，江晓楠，陈晓婷

（1.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000；2.佛山市国创生物发酵食品技术创新中心，广东 佛山 528000）

在细菌的代谢产物中，抗菌肽又被称为细菌素，既可以由革兰氏阳性细菌产生，也可以由革兰氏阴性细菌产生[1]。在革兰氏阳性细菌中，乳酸菌是一类产抗菌肽种类特别丰富的微生物[2]。近年来，乳酸菌抗菌肽在食品工业和医药方面潜在的应用前景，使得乳酸菌抗菌肽备受关注。很多抗菌肽都已被证明无论是在体外还是在体内，都可以有效抑制食源性致病菌和腐败菌[3]。乳酸菌抗菌肽作为一种天然防腐剂，已广泛应用在食品保藏中。乳酸菌抗菌肽的应用主要有2种途径。①直接加入产抗菌肽的乳酸菌。②直接加入制备出的抗菌肽（来源于纯化发酵上清液或人工合成）。

乳酸菌抗菌肽的广泛应用也极大地促进了检测、定量、纯化等下游过程的技术开发[4]。到目前为止，只有乳酸链球菌肽（Nisin ）被允许在食品中应用。然而，Nisin只能杀死或抑制革兰氏阳性细菌，且抗菌谱较窄。目前阻碍抗菌肽产业化的主要因素有2点。①缺乏能弥补Nisin缺陷的典型广谱抗菌肽。②乳酸菌抗菌肽产量低，纯化工艺烦琐、成本过高。基于此，本文主要对抗菌肽的纯化过程以及其中存在的问题进行了综述，为抗菌肽的规模纯化提供理论依据。

1 乳酸菌抗菌肽的主要类别及纯化方法

乳酸菌抗菌肽根据其结构和功能特性可分为4大类。①羊毛硫脂素类，主要特点是在其内部有修饰基团[5]。②无修饰抗菌肽，其主要特点是没有修饰基团，此类抗菌肽因结构特点可分为4种亚类，包括ClassⅠⅠa、Class ⅠⅠb、Class ⅠⅠc 和 Class ⅠⅠd[6]。③大分子热敏感抗菌肽[7]。④一种被糖基化或脂类修饰的抗菌肽[8]。前2类抗菌肽是目前研究的热点，也是本文综述的重点。

抗菌肽在分类上有所不同，但是其结构特点大体相同，都是由少量氨基组成的小肽，都含有阳离子、具有疏水性等。因此抗菌肽的纯化方法不尽相同，如利用盐析从发酵上清液中将抗菌肽沉淀出来或者酸提法，还有离子交换层析法、疏水层析法及凝胶过滤或反相色谱法。

2 乳酸菌抗菌肽的初分离

2.1.1 盐析法和有机溶剂法提取抗菌肽

乳酸菌抗菌肽是乳酸菌发酵后分泌的一种具有抑菌作用的小肽。为了研究其性质和结构，就需要从发酵上清液浓缩抗菌肽。盐析法是最为常用的方法，盐析法一般选用的试剂是硫酸铵，依据不同的饱和度将抗菌肽沉淀出来，抗菌肽的高盐稳定性使得硫酸铵饱和度达到80%也不会干扰其抗菌活性[9]。然而，盐析法操作烦琐、时间长、回收率低。因此，有研究人员根据抗菌肽在机溶液中具有一定的溶解性和稳定性（如丙酮、乙醇、氯仿），采用有机溶剂萃取法提取抗菌肽，结果证明可以有效提取抗菌肽[10]。有机溶剂萃取法也有一定缺点。①抗菌肽不一定存在于有机溶液中，而是主要存在于水相和有机相之间[11]。②并不是任何一种有机溶液都可以提取乳酸菌抗菌肽，有机溶液可以使某些抗菌肽失活[12]。

2.1.2 吸附解析法

由于硫酸铵沉淀和有机溶液的方法存在缺陷，YANG等人[13]研究出一种吸附-解析法，可以有效提取抗菌肽。这个方法主要是调整带有乳酸菌的发酵液pH值为5.0～7.0，使抗菌肽吸附在乳酸菌上，离心后得到菌体，用5%磷酸将抗菌肽从乳酸菌表面解析下来，可以有效浓缩抗菌肽。WAYAH等人[14]利用酸提取（pH为2.0）后，通过反相高效液相色谱法（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）RP-HPLC提取出高纯度的抗菌肽。根据YANG等人[13]的提取原理，又出现了很多有效的提取方法，如COVENTRY等人[15]利用Micro-Cel（一种食品级的硅藻土硅酸防结块剂）将抗菌肽吸附在上面，然后用1%脱氧胆酸盐溶液和1%SDS解析下来。JANES等人[16]研究出另外一种吸附解析方法，是将抗菌肽吸附在稻壳灰或硅酸上，在pH为2.5或3.0的酸性条件下90 ℃加热5 min进行解析。这种方法并不适用于每一种抗菌肽，有很多抗菌肽无法用吸附-解析法提取[17]，具有一定的限制性。

2.1.3 树脂法

一些羊毛硫脂素抗菌肽可以通过树脂吸附方法从发酵上清液中得到浓缩，常用树脂有Amberlite XAD-16、XAD-2、Serdolit PAD-Ⅰ[18-20]。这种方法可以减少发酵中的污染，但是树脂法并不适用于所有抗菌肽的提取，利用树脂提取双肽链抗菌肽，其提取率非常低，且树脂法无法大批量纯化抗菌肽[21]。

2.2 乳酸菌抗菌肽的精分离

2.2.1 传统精分离方法

乳酸菌抗菌肽的浓缩只是为了减少工作液的体积，并不能提高抗菌肽的纯度，因此需要应用一系列的色谱柱。可以利用抗菌肽含有阳离子以及疏水的特性使用不同类型的色谱柱。目前，阳离子交换色谱柱（SP-Sepharose或CM-Sepharose）最为常用，利用NaCl线性梯度洗脱可以分离抗菌肽，之后还可以利用疏水色谱柱（Phenyl-Sepharose或Octyl-Sepharose）进一步纯化，最后将有活性的部分收集起来，并通过RP-HPLC或者快速蛋白液相色谱（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）分离出高纯度的抗菌肽[22]。RP-HPLC是抗菌肽分离纯化的最后一步，虽然可以得到高纯度的抗菌肽，但是上样量低、产量少、损失大，不利于大规模提取抗菌肽。为了解决这一系列问题，提高回收率，CALLEWAERT等人[23]利用强阳离子柱，直接用发酵液上柱，但是没有得到很好的收回率。CALLEWAERT等人[23]又研究出了3步提纯的新方法：硫酸铵沉淀、用甲醇/氯仿提取、用RP-HPLC纯化。GUYONNET等人[24]报道的纯化方法，将培养基灭菌温度改为110 ℃，时间为12 min，以此减少培养基的颜色变化，用阳离子柱（Cellufine C-200）代替硫酸铵沉淀，并利用SEP C18，回收率最高可达60%，纯度在95%以上。UTENG等人[25]缩短了纯化步骤，形成二步分离法。第一步直接将菌体发酵液过阳离子交换柱（SP-Sepharose Fast Flow），用1 mol·L-1NaCl洗脱，第二步用反相快速蛋白色谱柱（Reversed-Phase Fast Protein Liquid Chromatography，RP-FPLC）进一步纯化，回收率达到90%以上。

2.2.2 免疫亲和纯化

免疫亲和纯化与上面提到的纯化方法原理不同，利用抗原与抗体结合相对专一的特点分离纯化抗菌肽，通过一步纯化就可以得到较高纯度的抗菌肽，研发人员采用Nisin A的单克隆抗体与HiTrap N-hydroxysuccinimide偶合，成功纯化出Nisin A[26]。除Nisin 外，已有很多单克隆抗体用于纯化抗菌肽，如Enterocin B、Nisin Z、Pediocin PA-1等。虽然很多乳酸菌抗菌肽的特异性抗体己经被报道，但是单克隆或多克隆抗体亲和层析柱主要还是应用于检测和定量，而不是应用在纯化抗菌肽方面。

2.2.3 其他分离纯化方法

DUTRA等人[27]提出简单而又快捷的提取方法，称为液体两相微细胞系统（Aqueous Two-Phase Micellar Systems，ATPMS）。这种方法可以直接从发酵液提取出纯度很高的生物分子并且满足工业化生产的要求。此外，研究人员广泛采用双水相系统法（Aqueous Two-Phase Systems，ATPS）提取乳酸菌抗菌肽。此方法主要试剂是聚乙二醇/葡聚糖、聚乙二醇/磷酸盐[28]。这种提取方法可以从复杂的培养基中大规模的提取生物分子，成本低，时间短。未来可能会成为大规模分离纯化抗菌肽的新方法。

3 影响乳酸菌抗菌肽纯化的因素

3.1 乳酸菌培养基类型对乳酸菌抗菌肽纯化的影响

乳酸菌是一种对营养要求很高的微生物，培养乳酸菌多数选择MRS、M17或GM17、Ellikert、APT等营养丰富的培养基[29]。这些培养基虽然有利于乳酸菌生长代谢合成抗菌肽，但同时也干扰了抗菌肽的分离纯化。BAREFOOT等人[30]研究表明，这些在MRS中的小分子肽虽然有利于抗菌肽Lactacin B的产生，却干扰了纯化过程。HASTⅠNGS等人[31]研究表明，半合成培养基比MRS培养基能减少培养基中的杂质对分离纯化过程的干扰。RAMMELSBERG等人[32]研究表明，复杂的培养基不适合纯化抗菌肽Caseicin 80，主要是受到一种未知的大分子物质影响。虽然复杂的培养基不利于分离纯化，但可以提高抗菌肽的产量，以满足分离纯化的要求。YANG等人[33]对比了Nisin、pediocin AcH，leuconocin Lcm1 和sakacin A在TGE培养中产量，发现pediocin AcH在无缓冲液的TGE培养基产量更好，而其他3种则在有缓冲液的TGE培养基产量更高。由此可知，为更好地分离纯化抗菌肽，需要对培养基进行优化或者筛选更为适合的培养基，从而去除干扰成分和杂质对抗菌肽纯化带来的影响。

3.2 培养基成分对乳酸菌抗菌肽纯化的影响

培养基中的成分不仅可以影响抗菌肽的产量，而且也会影响抗菌肽的分离纯化过程。MURⅠANA等人[34]发现，用硫酸铵沉淀含有Tween 80的发酵上清液，离心后的溶液为3层，包括表面薄层、底层沉淀、中间澄清层。抗菌肽Lactocin S离心后表面薄层中存在部分抗菌肽，而且在饱和度40%的硫酸铵沉淀Lactocin F时，有97%的抗菌活性在表面薄层中，只有3%在离心后的沉淀中。VAN LAACK等人[35]研究表明，在没有Tween 80的MRS培养基中培养乳酸菌，不仅影响乳酸菌的生长，而且抗菌肽的产量也会降低。KAWAⅠ等人[36]研究表明无Tween 80无法产生抗菌肽，用油酸代替Tween 80，结果抗菌肽gassericin A的活力提高了4 500倍。SAAVEDRA等人[20]通过调整灭菌温度，减少培养基颜色对分离纯化的污染。JⅠMENEZ等人[37]研究表明在MRS培养基中加入4%NaCl能提高抗菌肽的活性，同时还发现了另外一种抗菌肽plantaricin T。RAMMELSBERG等人[32]研究表明在SM-2培养基中加入蛋白胨，抗菌肽caseicin 80的产量提高2～3倍。DABA等人[38]研究表明在不同培养基中（MRS、Elliker、乳清）加入酵母提取物可以显著提高抗菌肽mesenteroides UL5的产量。但是蛋白胨和酵母提取物中含有大量的小分子肽类，加大了抗菌肽的分离纯化的难度。因此，最有效的减少培养基成分对抗菌肽分离纯化影响的方法就是预先对产抗菌肽的培养基进行优化。

3.3 分离纯化技术对乳酸菌抗菌肽的影响

在分离纯化乳酸菌抗菌肽的过程中，抗菌肽活性是评价抗菌肽分离纯化效果的关键指标。导致活性降低的因素主要有3类。①分离技术的选择，如超滤，疏水柱使用都会降低抗菌肽的活性，如在纯化caseicin 80过程中超滤损失大量caseicin 80，与之相反的是lactacin F经过超滤后其活性提高14倍[39]。②样品处理过程，如透析或冻干等，都可能造成活性大量损失[31,40]。③pH值的变化，在纯化过程中pH变化过大，也会导致抗菌肽活性下降，一般在酸性条件下有好的分离纯化效果。因此在抗菌肽的分离纯化过程中，尽量保持在酸性pH下，同时尽量减少不必要的样品处理工艺。选择适合的分离纯化工艺十分重要。

3.4 影响乳酸菌抗菌肽活力测定的因素

在乳酸菌抗菌肽分离纯化过程中，乳酸菌抗菌肽的活力测定、肽含量测定以及纯化倍数等都是十分重要的指标。在活力测定中最为常用的是以琼脂扩散为主要原理的牛津杯法和点种法。TAGG等人[41]指出，抗菌肽活性分析要结合测试条件和指示菌的灵敏性，同时指示菌的密度也是测定效价和选择方法的关键。测定蛋白浓度有很多方法，如Folin-Lowry法、Biuret法、Bradford法和BCA法，也有方法是直接用分光光度计在220 nm测定吸光度值。目前最为常用的是BCA法，其灵敏度高、稳定、干扰因素少。Tricine-SDS-PAGE是一种十分有效的方法，能判断测定半纯化或纯化后的抑菌物质为肽类或者是蛋白类，但是小分子疏水性抗菌肽类不适合用Tricine-SDS-PAGE电泳方法，因为小分子疏水性抗菌肽会弥散，从而无法通过染色看到肽类条带[42]。为了克服这一个问题，BHUNⅠA等人[43]研究出一种电泳法，将胶放在含指示菌的半固体培养基上，培养后形成可见的抑菌圈，根据预染Markers确定抗菌肽分子量范围。此外，SYPRO-Ruby新型染料的发明也弥补了抗菌肽无法染色的缺点，为抗菌肽的质谱和测序提供了可能。

3.5 影响乳酸菌抗菌肽的稳定性的因素

目前，很多文献报道纯化后的抗菌肽稳定性会变弱。如纯化后的抗菌肽mesentericin Y105和leucocin A-UAL187性质不稳定。PAULA等人[44]分析表明抗菌肽在低pH值环境中保存比高pH值更为稳定。在中性或高pH值中，抗菌肽容易被蛋白酶水解失活或者自身聚合。温度也是影响因素之一，DAVY等人[45]研究表明，纯化后抗菌肽在4 ℃或室温条件下一周就完全失活。ABRⅠOUEL等人[46]研究表明，AS-48在发生聚合后依然具有抗菌肽活性。此外，温度、pH、金属离子、蛋白酶、反复冻融和化学试剂都会对抗菌肽活性产生影响。

加入稳定剂有助于保护抗菌肽的活性，防止肽类聚合。常用的保护剂有以下几种。①糖类/多元醇，如蔗糖、海藻糖、甘露醇及葡萄糖。②聚合物，如HES、PVP、PEG、葡聚糖及清蛋白等。③无水溶剂，如乙烯乙二醇、甘油、DMSO及DMF等。④表面活性剂，如Tween 80等。⑤氨基酸，如苏氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、谷氨酸及肌氨酸等。⑥盐类，如磷酸盐、醋酸盐及柠檬酸盐等[47-49]。

4 结语

乳酸菌抗菌肽的分离纯化经历几十年的发展已经进入重要的阶段，目前乳酸菌抗菌肽的回收率依然面临3个重要问题。分离过程需要大幅缩短时间和简化工艺，减少乳酸菌抗菌肽的损失。乳酸菌抗菌肽回收率低，达不到工业化生产的要求。分离纯化抗菌肽的过程大量使用有机溶剂会引发环境污染问题仍需考虑。但随着乳酸菌分离纯化工艺的进步，更多乳酸菌抗菌肽提取方法被研发与应用，将会有更多乳酸菌抗菌肽被大规模工业化生产，应用于食品领域。