非酒精性脂肪性肝病人群细胞角蛋白18水平与2型糖尿病发病风险

扈若凡 徐少勇,2 沈涵,3 景策,4 贾爱华,5 鱼馨文 邢影 梁声茹 明洁 姬秋和

1空军军医大学附属西京医院内分泌科，西安 710032; 2湖北文理学院襄阳市中心医院内分泌科 441021; 3北京四季青医院内科 100097; 4首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科 100176; 5榆林市第一医院内分泌科 718000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征[1-2]。NAFLD已成为21世纪影响公众健康的重要疾病之一，2016年的一项荟萃分析显示，NAFLD的全球患病率为25.24%[3]。细胞角蛋白-18(CK-18)是一种肝脏蛋白质代谢的中间产物，能够反映非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中肝细胞凋亡的程度，并与NASH炎性反应和肝纤维化程度密切相关。在《NAFLD防治指南(2018更新版)》中的推荐意见提出，CK-18持续升高的NAFLD患者是NASH的高危人群，建议通过肝组织活检明确诊断[4]。研究发现，与未患2型糖尿病(T2DM)者相比，患有T2DM的NAFLD者基线CK-18水平明显升高[5]。CK-18的测定可能是NAFLD人群中T2DM发生、发展的一个有用指标。但既往研究样本量较小，研究结果可能有潜在的选择性偏倚。另一项研究发现空腹血糖与血清CK-18水平呈正相关，且这种相关性可能与NAFLD无关，但研究是在T2DM人群中进行的[6]。因此有必要进行大规模人群研究来验证。

本研究的目的是探讨以超声诊断的NAFLD人群中，血清CK-18水平是否与T2DM风险相关。

1 对象与方法

1.1 研究对象 根据2007—2008年中国糖尿病和代谢紊乱调查(CNDMDS)的结果，进行为期至少5年的队列研究。基线研究于2007年8月至2008年6月完成，后续研究于2012年6月至2013年10月完成。每次研究受试者都填写相同的问卷。在陕西省西安地区(包括市、县、乡、村)的CNDMDS中共招募1 915名受试者，806名受试者(42.1%)同意参与研究并完成随访问卷。排除了在基线时通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)或自我报告的T2DM患者、糖尿病前期者、酒精过量摄入者、关键数据缺失、怀疑继发于肝硬化或恶性肿瘤者、CK-18缺失者或血清CK-18异常者，最终共有457名受试者纳入本研究作为研究人群。

糖尿病诊断标准根据1999年WHO标准[7]。糖尿病：空腹血糖≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)餐后2 h血糖(2 hPPG)≥11.1 mmol/L或自我报告的正在服用降糖药物。糖尿病前期：6.1 mmol/L≤空腹血糖<7.0 mmol/L 为空腹血糖受损(IFG)； 7.8 mmol/L≤2 hPPG<11.1 mmol/L为糖耐量减低(IGT)。正常血糖：空腹血糖<6.1 mmol/L且OGTT 2 hPPG< 7.8 mmol/L。NAFLD的诊断标准具备以下 3 项腹部超声表现中的 2 项，且排除过量饮酒和其他影响因素：肝脏近场回声弥漫性增强(“明亮肝”) ，回声强于肾脏；肝内管道结构显示不清；肝脏远场回声逐渐衰减[8]。

根据上述纳入标准，本研究共纳入457名受试者。根据超声对脂肪肝的诊断，分为NAFLD组(94例)和非NAFLD组(363例)。根据CK-18水平，NAFLD组被进一步分为高CK-18-NAFLD组(48例)和低CK-18-NAFLD组(46例)。研究方案符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，经第四军医大学西京医院独立伦理委员会批准。所有受试者在研究开始前均被告知并签署了知情同意书。

1.2 数据采集 接受统一培训的医生或护士使用标准化问卷收集人口学资料、疾病个人史、家族史和生活方式的数据。本研究中吸烟者被定义为在其一生中至少吸烟100支的人；饮酒被定义为在1年内每周摄入至少30 g酒精；定期体育锻炼被定义为每周至少进行3次体育活动，每次至少30 min。

1.2.1 CK-18测量 使用M30凋亡酶联免疫吸附检测(Apoptosis Biomarker Assay)试剂盒(Peviva，斯德哥尔摩，瑞典)和多功能酶标仪Spectra Max 190 Molecular Devices(Tecan Trading AG，瑞士)测定血清CK-18。

1.2.2 人体测量学指标 受试者赤足身着轻便衣物测量身高和体重。体重指数使用体重(kg)/身高2(m2)计算。腰围测定要求受试者站立时体重均匀分布，并使用卷尺测量髂前上棘和第十二肋骨下缘之间中点的径线，测得的腰围精确到0.1 cm。在安静环境下休息至少5 min后，使用台式水银血压计测量右上臂两次血压。所有受试者禁食至少8 h，无糖尿病病史受试者进行75 g OGTT，有糖尿病病史的受试者进行馒头餐试验以确保安全。采集空腹血测定甘油三酯、高密度脂蛋白-胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、总胆固醇和胰岛素。

2 结果

在参与基线研究的1 915名受试者中，806名受试者(42.1%)同意并完成5年随访研究。3组在年龄、吸烟史、运动史、糖尿病家族史、收缩压和舒张压上均无显著性差异(P均>0.05)。然而，高CK-18-NAFLD和低CK-18-NAFLD组的性别、体重指数、空腹血糖、甘油三酯和高密度脂蛋白-胆固醇水平均显著高于非NAFLD组(P均<0.001)，见表1。

457名受试者基线时血清CK-18水平为125.3 U/L(95%CI: 57.3～476.6)，数据分布如图1所示。血清CK-18在高CK-18-NAFLD组为235.9(167.3，392.5)U/L，显著高于非-NAFLD组[(120.6(87.6，186.3)U/L，F=116.019，P<0.001]。血清CK-18在低CK-18-NAFLD组[(105.2(75.6，116.9)]U/L和非NAFLD组之间差异无统计学意义(F=0.457，P=0.068)，见图2。

经过5年的随访，457名受试者中有19例诊断为糖尿病。非NAFLD组、低CK-18-NAFLD组和高CK-18-NAFLD组的T2DM发病率分别为2.5%(9/363)、8.7%(4/46)和12.5%(6/48)。

Cox比例风险回归模型显示，与非NAFLD组相比，经多变量调整后，低CK-18-NAFLD组和高CK-18-NAFLD组T2DM相对的发病风险(RR)分别为3.37(95%CI: 1.05～10.86，P=0.042)和4.71(95%CI: 1.71～12.99，P=0.003)，见表2。

3 讨论

本研究为后续研究，笔者之前的研究发现，患有NAFLD的中国人群T2DM的发病风险显著增加，NAFLD是T2DM的独立预测因子[9]。这项早期研究的结果与其他既往的研究一致[10-12]。而本研究是基于人群并有5年随访期的队列研究，结果也提示NAFLD人群患T2DM的5年风险更高。

表1 研究人群基线资料

表2 NAFLD与T2DM发病风险的回归分析

CK-18是肝脏主要的蛋白质代谢中间产物，凋亡细胞会因细胞基质的完整性丧失而大量释放CK-18[13]。由于CK-18主要由caspase-3产生，而caspase-3在NASH肝中有活性[14]。因此NASH患者血清CK-18可能升高。表明CK-18在某种程度上可以作为反映NAFLD纤维化程度的一种生物标志物[15-17]。Nagpal等[5]研究评估了肝活检诊断的NAFLD患者的基线CK-18水平是否可以预测糖尿病的未来发展。然而，这项研究的样本量较小(仅跟踪了25例患者)。因此，作者无法推导出CK-18预测糖尿病发病风险的RR值，并且无法在分析中校正相关影响因素。同时，研究人群中可能存在选择偏倚，因为接受肝活检的受试者可能有更严重的NAFLD。此外，理想情况下，应纳入没有任何NAFLD证据的健康人群作对照组[18]。尽管如此，这项初步研究仍然很有意义，因为它表明基线血清CK-18可用于预测NAFLD患者糖尿病的发展。

本研究是一项基于人群的队列研究，结果证明NAFLD患者血清CK-18水平升高与T2DM的发病风险升高可能存在相关性。与非NAFLD组相比，低CK-18-NAFLD组和高CK-18-NAFLD组的RR值分别为3.37(95%CI: 1.05～10.86)和4.71(95%CI: 1.71～12.99)，提示在NAFLD人群中，高CK-18水平可能伴随着更高的糖尿病发病风险。尽管与高CK-18-NAFLD组相比，低CK-18-NAFLD组的T2DM发病风险并未有显著性差异(RR=1.682，95%CI：0.321～5.315)，这主要是因为样本量不足所致。考虑到以人群为基础的队列研究的困难，基于本研究的94例NAFLD患者的样本量仅能提供51.99%(RR=1.682,α=0.05，SD=1.25)的把握度。但是本研究提示CK-18在NAFLD中可能用于预测糖尿病的发病风险，未来仍需要更多和更大样本量的相关研究。

与Nagpal等[5]的研究不同，本研究没有使用肝活检来证实NAFLD，意味着结论可能只能是暂时性的。NAFLD患者T2DM的风险显著增加，提示应寻找更准确、无创的方法来确定高危人群。超声由于其便于实际应用的优点，在脂肪肝的临床筛查中得到了广泛的应用。CK-18检测作为另一项无创性研究，除可能为NASH与其他NAFLD的鉴别提供额外的信息外，还可能用于筛查糖尿病的发病风险。因此，建议首先使用超声筛查NAFLD，如果可能的话，随后使用CK-18检测筛查有较高糖尿病风险的个体，以便在疾病早期提供积极的治疗。

本研究设计相对严密，但仍有局限性。首先，随访率仍然相对较低(42.1%)，这是我国所有基于人群的队列研究面临的共同问题。其次，本研究大多数受试者没有肝纤维化的迹象，并且在高CK-18-NAFLD组中受试者的数量相对较少。最后，由于没有进行肝活检，本研究无法定义一个合适的CK-18浓度切点来明确区分NASH和单纯NAFLD，因此只能采用两分法进行分组研究。

综上所述，本研究表明，超声诊断的NAFLD患者CK-18水平与T2DM风险存在相关性。因为超声和CK-18检测都是无创性检查，建议首先使用超声筛查NAFLD；如果可能，使用CK-18检测筛查出具有更高糖尿病患病风险的人群，这将有助于在疾病的早期阶段进行积极主动的管控。