猪肺炎支原体HNMhy1株免疫原性基因的鉴定与分析

徐引弟，张青娴，王治方，焦文强，李海利，朱文豪，王克领

(河南省农业科学院 畜牧兽医研究所/河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002)

猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)主要引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)，同时也是在猪群中引起呼吸道疾病综合征的几种主要病原菌之一[1-5]。由于猪肺炎支原体缺乏细胞壁，其主要的抗原物质存在于细胞膜，细胞膜由脂质和蛋白质组成。猪肺炎支原体主要的膜蛋白有选择性的被共价类脂束缚，脂蛋白为支原体膜的主要成分，在感染的免疫和诊断中起着重要作用。目前，研究较多的膜蛋白主要有P36、P46、P65、P42、P97和P110等。P36蛋白是猪肺炎支原体的种特异性蛋白，是一种早期免疫原性蛋白，在其感染过程中可能起着主要作用。猪肺炎支原体感染后能产生针对P36特异的抗体，可用于其诊断及免疫保护性分析。P46蛋白也是一种具有种特异性、可引起早期免疫反应的表面脂蛋白。P65蛋白是主要的免疫脂蛋白，有类似脂酶的特性，偏爱短链脂肪酸，具有很高的种间保守性和特异性。P97蛋白是一种猪肺炎支原体黏附素蛋白，与纤毛结合有关，也是最主要的免疫原性蛋白。猪肺炎支原体的致病过程是一个非常复杂的病理过程，黏附因子、细胞毒性、免疫调节及免疫逃逸等是影响其致病力的主要因素。由于猪肺炎支原体主要存在于动物呼吸道表面，致病性黏附因子(如P97、P145和P57蛋白)的黏附能力对其致病性起着首要作用。此外，目前发现的猪肺炎支原体膜蛋白还有P110、P159、P102、P116、P216、P271、P107等。猪肺炎支原体与猪呼吸道纤毛的黏附机制还没有研究透彻，对这些黏附蛋白的研究将有利于其致病机制的研究和疾病的诊断与防治[6-9]。

为了对猪肺炎支原体的致病机制及其黏附因子的黏附机制有进一步研究，从而对河南猪肺炎支原体的遗传变异及分子流行病学有更深入研究，以防控猪支原体肺炎，在分离鉴定了猪肺炎支原体河南分离株HNMhy1的基础上，开展了主要免疫原性基因的鉴定分析，并对其分子流行病学进行研究，旨在为研究高效、安全的猪肺炎支原体疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病料与参考毒株

供试毒株于2017年4月分离自河南省濮阳市某大型猪场发生重症肺炎呼吸困难的2月龄保育猪的肺脏，命名为HNMhy1，保藏编号为CGMCC No.：13858，保藏日期为2017年5月26日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号。参考毒株为猪肺炎支原体168疫苗株，购自南京天邦生物公司。

1.2 主要试剂

PPLO肉汤粉、酵母粉、琼脂粉均购自美国BD公司，葡萄糖、酚红购自上海国药集团公司，MEM、马血清等均购自美国Hyclone公司，青霉素购自华北制药集团公司，L-精氨酸购自美国Roche公司， 2×PCR Mix、DL2000 Marker、Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 基因的扩增

1.3.1 引物的设计 根据猪肺炎支原体P36、P46、P97、P110、P65基因序列设计引物[10-17]。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR扩增引物Tab.1 Primers of PCR amplification

1.3.2 DNA提取 将猪肺炎支原体 HNMhy1株接种于PPLO液体培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养5 d，参考文献[10]的方法进行培养。1 2000 r/min离心10 min收集菌体，按照DNA提取试剂盒操作说明提取DNA。

1.3.3 PCR扩增 PCR体系为25 μL：2× PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL，待测DNA 2 μL。

PCR扩增程序：95 ℃ 4 min；然后35个循环：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；最后72 ℃ 5 min。取10 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4 基因序列分析

将阳性PCR产物回收，16 ℃连接PMD19-T载体过夜，转化JM109感受态细胞，涂布含AMP、x-gal、IPTG的LB平板，37 ℃培养过夜，挑取白斑于含AMP的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒，进行PCR检测，将阳性质粒送上海生工生物公司测序，测序序列用BLAST软件进行分析。

1.5 基因进化分析

使用DNAStar软件进行基因序列统计和进化分析，将猪肺炎支原体分离株HNMhy1的P36基因核苷酸序列与GenBank中的国内外其他分离株(表2)进行同源性比较，构建系统进化树，分析分离株遗传变异特点。

表2 P36基因参考序列Tab.2 P36 gene reference sequence

2 结果与分析

2.1 猪肺炎支原体免疫原性基因的扩增

根据猪肺炎支原体P36、P46、P97、P65、P110序列设计相关引物，以临床分离的猪肺炎支原体 HNMhy1株为模板，通过 PCR 扩增反应得到的产物经过琼脂糖凝胶电泳，P36基因扩增片段长约948 bp，P46基因扩增片段长约1 260 bp，P97基因扩增长约片段639 bp，P65基因扩增片段长约1 803 bp，P110基因扩增片段长约717 bp，与预期大小均一致(图1)。

A.P36基因(M.DL2000 Marker；1,3.HNMhy1；2.阴性对照；4.阳性对照);B.P46基因(M.DL2000 Marker；1.阴性对照；2,3.HNMhy1；4.阳性对照);C.P97基因(M.DL2000 Marker；1—3.HNMhy1；4.阳性对照);D.P65基因(M.DL2000 Marker；1,3.HNMhy1；2.阴性对照；4.阳性对照);E.P110基因(M.DL2000 Marker；1—3.HNMhy1；4.阳性对照) A.P36 gene(M.DL2000 Marker;1,3.HNMhy1;2.Negative control;4.Positive control);B.P46 gene(M.DL2000 Marker;1.Negative control;2,3.HNMhy1;4.Positive control);C.P97 gene(M.DL2000 Marker;1—3.HNMhy1;4.Positive control);D.P65 gene(M.DL2000 Marker;1,3.HNMhy1;2.Negative control;4.Positive control);E.P110 gene(M.DL2000 Marker;1—3.HNMhy1;4.Positive control)图1 P36、P46、P97、P65、P110基因的 PCR 扩增结果Fig.1 Amplification results of P36,P46,P97,P65,P110 gene by PCR

2.2 猪肺炎支原体免疫原性基因的序列分析

将扩增的猪肺炎支原体分离株HNMhy1的主要免疫原性基因片段回收纯化，分别连接pMD19-T载体，然后转化JM109，进行测序。将目的片段序列分别与GenBank中的序列进行比对，发现与已公布的猪肺炎支原体菌株的P36、P46、P97、P65、P110序列的同源性较高，均在98%以上，部分毒株同源性高达100%(表3)。

表3 HNMhy1株扩增片段与GenBank中Mhp比对结果Tab.3 Comparison of nucleotide sequences from amplified fragments of HNMhy1 with corresponding sequences of Mhp in GenBank %

2.3 猪肺炎支原体免疫原性基因的进化分析

使用DNAStar软件进行基因序列统计和进化分析，将猪肺炎支原体分离株HNMhy1的P36基因的核苷酸序列与GenBank中其他菌株基因序列进行比对，P36与其他毒株的同源性均在98%以上(图2)。基于P36基因的序列分析及系统进化树分析显示，P36基因与国内外报道的其他毒株的P36基因高度同源，极为保守。系统进化树显示，19株猪肺炎支原体形成2个大支，其中HNMhy1株与7488株、7422株、J株、168株、韩国分离株(KM014)、比利时分离株(F7.2C)、瑞士分离株(NCTC10110)、湖北株(ES-2)、江苏株(ZCF23)、湖南株(HN13、HN6、HN17、HN1001)等在同一分支，而232株与英国株(NCTC10127)、湖南株(HN2、HN3、TZ-1)在另一分支；HNMhy1株与湖南株HN13最近(图3)。可见，HNMhy1株P36基因极为保守。

3 结论与讨论

猪肺炎支原体感染在世界范围内高度流行，给养猪业造成巨大的经济损失。猪肺炎支原体生长缓慢，很难分离。猪肺炎支原体的基因组全长约900 kb，编码区约700 bp，其中约1/3编码菌体表面蛋白，不同的蛋白质在猪肺炎支原体的致病过程中发挥不同的作用。本研究对分离的猪肺炎支原体HNMhy1株的主要的免疫原性基因P36、P46、P97、P65、P110进行了扩增测序，与GenBank中的现有序列进行比对，发现与已公布的猪肺炎支原体菌株的序列的同源性均在98%以上，部分毒株同源性高达100%，表明分离株的P36、P46、P97、P65、P110这5个主要的免疫原性基因是比较保守的，与国内外其他报道一致[10-20]。

本研究对猪肺炎支原体河南分离株HNMhy1的P36、P46、P97、P65、P110基因的序列进行比对分析，发现 HNMhy1株的主要免疫原性基因高度保守，在遗传演化中未发生太大变化。