稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性及两者的协同作用

刘世江，赵琪君，丁 怡，李荣玉,3，李 明,3，吴小毛,3

(1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 猕猴桃工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025； 3.贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的真菌性病害，是水稻生产中三大病害之一，发生范围广泛，轻者导致减产10%～20%，重者减产40%～50%，甚至绝收，严重制约水稻的品质、产量[1-3]。防治稻瘟病的主要措施有种植抗病品种、采用合理的栽培管理措施、化学药剂防治等，其中，化学防治具有经济、简便、见效快等特点，起着不可替代的作用[4]。目前，用于防治稻瘟病的化学药剂主要有稻瘟灵、异稻瘟净、咪鲜胺、多菌灵、肟菌酯、春雷霉素、烯肟菌胺、嘧菌酯、醚菌酯、三环唑和戊唑醇等[5]。一些化学药剂由于长期单一使用，在一些地区已经产生抗药性，导致防治效果下降，如稻瘟灵、异稻瘟净等药剂都已产生抗性菌株[6]。

咪鲜胺(Prochloraz)属于麦角甾醇生物合成抑制剂，对子囊菌和半知菌引起的真菌病害防治效果较好[7]，广泛应用于防治稻瘟病、稻曲病、水稻恶苗病等水稻病害[8]。三环唑(Tricyclazole)属于黑色素合成抑制剂，具有高效、低毒、内吸性强等特点，产生间接化合物作用于病原菌，被广泛应用于稻瘟病的防治[9]。随着咪鲜胺和三环唑在稻瘟病防治上的广泛使用，中国部分稻区出现三环唑防效下降的现象[10]，一些研究者对其敏感性进行了研究，但稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感基线研究较少，仅郑丽娜[11]、祁之秋等[12]分别建立了黑龙江省、辽宁省稻瘟病菌对咪鲜胺的敏感基线，车淑静[13]建立了黑龙江省稻瘟病菌对三环唑的敏感基线，而南方稻区则未见相关报道。为此，以2017年从南方及河南南部稻区分离得到的稻瘟病菌菌株为研究对象，采用菌丝生长速率法测定稻瘟病菌菌株对咪鲜胺的敏感性，采用水稻苗活体法测定稻瘟病菌菌株对三环唑的敏感性及咪鲜胺和三环唑的协同作用，建立稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感基线，分析不同地区稻瘟病菌的敏感性差异，为评估咪鲜胺、三环唑的抗药性风险和科学施药提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 2017年从贵州省黄平县(HP)、湄潭县(MT)、贵安新区(GA)，湖北省武穴市(WX)、江夏区(JX)，湖南省长沙市(CS)，河南省信阳市(XY)7个市(县、区)稻区采集稻瘟病样本，分离稻瘟病菌菌株。

1.1.2 供试药剂及水稻品种 98%咪鲜胺原药，江苏辉丰生物农业股份有限公司生产；95%三环唑原药，江苏耕耘化学有限公司生产；用丙酮配制成10 000 μg/mL母液，置于4 ℃冰箱保存备用。75%三环唑可湿性粉剂(WP)，江西中讯农化有限公司生产；45%咪鲜胺水乳剂(EW)，华北制药集团爱诺有限公司生产。水稻品种为大粒香，购自贵州省湄潭县竹香米业有限责任公司，在人工气候箱中用营养液培育水稻苗。

1.1.3 供试培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，琼脂15～20 g，葡萄糖20 g，去离子水1 000 mL；米糠培养基：米糠20 g，葡萄糖10 g，琼脂10～15 g，去离子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病菌的分离、纯化及保存 采用单孢分离法[14]，将发病组织沿病斑剪下(约1～2 cm)，乙醇消毒(30 s)后用无菌水冲洗，放入铺有湿润滤纸的培养皿中，置于28 ℃培养箱中培养24～48 h。将产生深灰色霉层的病斑放在显微镜下挑取单孢子，贴在培养基上，密封置于28 ℃培养箱中培养5～7 d，长满孢子后进行纯化，转接至试管斜面，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 稻瘟病菌孢子悬浮液的制备 采用米糠培养基进行产孢[15]，取培养好的稻瘟病菌接种到米糠培养基平板上，置于28 ℃培养箱中培养8～10 d，将少量无菌水倒入长满菌丝的培养皿中，用毛笔轻轻洗刷培养基表面。然后置于黑光灯(365 nm)下28 ℃培养48 h，培养基表面产生大量孢子后，倒入少量无菌水洗刷表面，过滤镜检，配制成所需要浓度的孢子悬浮液。

1.2.3 稻瘟病菌对咪鲜胺的敏感性测定 采用菌丝生长速率法[16]。将咪鲜胺原药母液配制成系列浓度梯度的稀释液，按比例与PDA培养基混合，倒入灭菌的培养皿中，配制成含系列浓度咪鲜胺的PDA培养基平板。用直径6 mm的打孔器切取稻瘟病菌菌饼，接种至含药PDA培养基平板上，以不加药剂为空白对照，每个处理重复3次，密封置于28 ℃培养箱培养5～7 d。采用十字交叉法分别测量每个菌落的直径，计算测量数据。

1.2.4 稻瘟病菌对三环唑的敏感性测定 参考张传清等[17]的方法，测定稻瘟病菌对三环唑的敏感性。取培养至三叶一心的水稻苗，用系列浓度的三环唑原药稀释液喷雾处理，24 h后用培养好的孢子悬浮液喷雾接种处理好的水稻苗，置于人工气候箱，100%保湿，黑暗培养36 h后，光暗交替，80%相对湿度，25 ℃培养，每个处理3次重复，7 d后调查发病情况。

1.2.5 咪鲜胺与三环唑不同组合对稻瘟病菌的联合作用测定 将咪鲜胺原药与三环唑原药按有效成分比为1∶20、2∶20、3∶20、4∶20、5∶20进行组合，配制成系列浓度药液进行喷雾处理，具体方法参照1.2.4。

1.2.6 咪鲜胺与三环唑增效组合对稻瘟病的田间防效试验 根据1.2.5的试验结果，选择增效显著的组合咪鲜胺、三环唑组合(有效成分比4∶20，)进行田间防效试验。于2019年在贵州省黄平县旧州镇按照《农药 田间药效试验准则(一) 杀菌剂防治水稻叶部病害》(GB/T 17980.19—2000)的方法进行。试验地水肥充足、地势平坦。试验设6个处理：75%三环唑WP 330 g/hm2、45%咪鲜胺EW 360 g/hm2、45%咪鲜胺EW与75%三环唑WP组合(有效成分比4∶20)90 g/hm2、45%咪鲜胺EW与75%三环唑WP组合(4∶20)180 g/hm2、45%咪鲜胺EW与75%三环唑WP组合(4∶20)360 g/hm2、清水对照。每个处理4次重复，共24个小区，每个小区面积30 m2，随机区组排列，小区之间设置30 cm保护行。分别于施药后7、14、21 d调查记录总株数、病株数和各病级数，计算病情指数和防效。

1.3 数据处理与分析

利用Excel 2010对数据进行处理，得到毒力回归方程及相关系数(r)，计算咪鲜胺、三环唑对各菌株的有效抑制中浓度(EC50)。利用SPSS 24对菌株EC50值进行聚类分析。参考张蕊蕊等[18]的方法求组合共毒系数(CTC)，共毒系数<80为拮抗作用；介于80～120为相加作用；>120为增效作用。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性及敏感基线

从稻瘟病发病样本上共分离纯化得到103株稻瘟病菌菌株。由图1可见，103株供试稻瘟病菌菌株对咪鲜胺的敏感性呈连续性分布(图1)，EC50值介于0.004 2～0.056 μg/mL，均值为0.027 μg/mL。其中，敏感性较弱的稻瘟病菌菌株(贵安新区GA2)EC50值是敏感性较强菌株(信阳XY14)的13.33倍。在EC50值范围内，从0.004 0 μg/mL开始，设置组距为0.006 5 μg/mL，将其划分为8个组，统计各组的菌株数量，计算其占总体的频率，得到敏感性频率分布(图2)。在敏感性频率分布中，0.024～0.030 μg/mL区间的菌株数量最多，其频率为25.20%，敏感性频率分布为连续单峰曲线，且80%稻瘟病菌群体对咪鲜胺的敏感性频率近似于正态分布(P=0.081>0.05)。在药剂作用下，根据病原菌对药剂敏感性呈正态分布的原理[12]，可将EC50均值0.027 μg/mL作为稻瘟病菌对咪鲜胺敏感基线的参考值。

103株供试稻瘟病菌菌株对三环唑的敏感性也呈连续性分布(图1)，EC50值介于0.35～9.67 μg/mL，均值为5.24 μg/mL。其中，敏感性较弱的稻瘟病菌菌株(贵安GA12)EC50值是敏感性较强菌株(信阳XY6)的27.63倍。在菌株EC50值范围内，从0.35 μg/mL开始，设置组距为1.37 μg/mL，将其划分为7个组，统计各组的菌株数量，计算其占总体的频率，得到敏感性频率分布(图2)。在敏感性频率分布中，4.460～5.830 μg/mL区间的菌株数量最多，其频率为29.13%，敏感性频率分布为连续单峰曲线，且稻瘟病菌群体对三环唑的敏感性频率近似于正态分布(P=0.269>0.05)。在药剂作用下，病原菌对药剂的敏感性呈正态分布，因此，可将EC50均值5.24 μg/mL作为稻瘟病菌对三环唑敏感基线的参考值。

图1 稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性Fig.1 EC50 values of prochloraz and tricyclazole to M.oryzae populations

图2 稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性频率分布

2.2 不同地区稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性

表1表明，咪鲜胺对贵州省贵安新区稻瘟病菌EC50值显著高于对贵州省黄平县、河南省信阳市、湖北省武穴市稻瘟病菌EC50值，除贵安新区外，咪鲜胺对其他6个地区稻瘟病菌的EC50值差异不显著。其中，贵州省贵安新区稻瘟病菌对咪鲜胺较不敏感，EC50均值为0.035 8 μg/mL，河南省信阳市稻瘟病菌对咪鲜胺较为敏感，EC50均值为0.019 8 μg/mL，咪鲜胺对贵州省贵安新区稻瘟病菌的EC50值是对河南省信阳市稻瘟病菌EC50值的1.8倍。各地区稻瘟病菌对三环唑的敏感性差异不显著。

表1 不同地区稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性比较Tab.1 Sensitivity of M.oryzae to prochloraz and tricyclazole from different areas

2.3 咪鲜胺和三环唑对稻瘟病菌的协同作用分析

表2表明，咪鲜胺EC50值为0.34 μg/mL，三环唑EC50值为3.58 μg/mL，咪鲜胺与三环唑有效成分比为1∶20、2∶20、3∶20、4∶20、5∶20的EC50值分别为3.31、2.35、2.23、1.10、1.56 μg/mL。其中，当咪鲜胺与三环唑有效成分比为1∶20、2∶20、3∶20、5∶20时，共毒系数均大于80且小于120，表现为相加作用；当咪鲜胺与三环唑有效成分比为4∶20时，其共毒系数为177.10，增效作用明显，为二者的增效组合。

2.4 咪鲜胺和三环唑增效组合对水稻稻瘟病的田间防效

表3表明，咪鲜胺与三环唑(4∶20)组合对水稻稻瘟病均表现出良好的防治效果，且试验期间各处理对水稻生长无不良影响。其中，180 g/hm2咪鲜胺与三环唑(4∶20)组合对水稻稻瘟病的防治效果显著高于45%咪鲜胺EW和75%三环唑WP。施药后7 d，180 g/hm2咪鲜胺与三环唑(4∶20)组合对水稻稻瘟病的防治效果为68.85%，显著高于45%咪鲜胺EW(59.27%)和75%三环唑WP(30.64%)；施药后14 d，180 g/hm2咪鲜胺与三环唑(4∶20)组合对水稻稻瘟病的防治效果为82.29%，显著高于45%咪鲜胺EW(80.38%)和75%三环唑WP(28.89%)；施药后21 d，180 g/hm2咪鲜胺与三环唑(4∶20)组合对水稻稻瘟病的防治效果仍达到86.41%，显著高于45%咪鲜胺EW(82.93%)和75%三环唑WP(27.34%)。

表2 咪鲜胺和三环唑对稻瘟病菌的联合毒力Tab.2 Co-toxicity of prochloraz and tricyclazole to M.oryzae

表3 咪鲜胺·三环唑增效组合对水稻稻瘟病的防治效果Tab.3 Control effect of prochlorazole and ricyclazole combination to rice blast

3 结论与讨论

本研究通过测定稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感性以及2种药剂的协同作用，建立了稻瘟病菌对咪鲜胺和三环唑的敏感基线，分别为0.027、5.24 μg/mL，筛选出咪鲜胺·三环唑的增效组合有效成为比为4∶20。而祁之秋等[12]建立辽宁省稻瘟病菌对咪鲜胺的敏感基线为0.071 μg/mL，郑丽娜[11]建立黑龙江省稻瘟病菌对咪鲜胺的敏感基线为0.049 1 μg/mL，车淑静[13]采用菌丝生长速率法建立黑龙江省稻瘟病菌对三环唑的敏感基线为32.24 μg/mL，与本研究建立的敏感基线均有一定差距，这可能与其采用的测定方法、地区病原菌生理小种、药剂选择以及用药时间不同有关[19]。刘显元[20]研究结果表明，黑龙江部分地区的稻瘟病菌对三环唑产生了一定的抗药性，且有上升的趋势；而何海永等[21]研究贵州省稻瘟病菌对三环唑的抗药性，结果表明，稻瘟病菌对三环唑仍处于敏感或低抗水平，本研究结果也未发现抗性菌株。咪鲜胺和三环唑按有效成分比4∶20组合对稻瘟病菌具有增效作用，且田间小区试验表明，咪鲜胺·三环唑(4∶20)180 g/hm2对水稻稻瘟病的防效达到86.41%，防治效果优于单剂。

咪鲜胺、三环唑对分离纯化得到的103株稻瘟病菌菌株的EC50值分别为0.004 2～0.056、0.35～9.67 μg/mL，稻瘟病菌不同菌株对药剂的敏感性差异较大，这可能与病原菌本身的差异以及群体组成的复杂多样性有关，也可能与使用其他药剂之间存在的微弱交互抗性有关[12]。咪鲜胺对贵州省贵安新区稻瘟病菌群体的EC50值显著高于对贵州省黄平县、河南省信阳市、湖北省武穴市稻瘟病菌的EC50值，而不同地区稻瘟病菌群体对三环唑的敏感性没有显著差异。

咪鲜胺通过抑制甾醇物质合成，干扰病原菌细胞壁功能，导致病原菌死亡；三环唑能抑制附着孢的黑色素形成，孢子不能萌发，从而达到防治病害的效果。目前还未见稻瘟病菌对咪鲜胺产生抗性的报道，赵东磊等[22]研究表明，稻瘟病菌对咪鲜胺的抗性风险属于低抗水平。张杨等[23]通过紫外线和亚硝基胍(MNNG)方法诱导获得三环唑抗性菌株，对其研究表明，稻瘟病菌对三环唑属于低抗药性风险。综上所述，咪鲜胺、三环唑仍适用于稻瘟病的防治，使用时应考虑与其他作用机制不同的杀菌剂结合使用，以延缓抗药性的产生，延长药剂使用寿命。本研究结果显示，咪鲜胺与三环唑4∶20混合使用，可提高对稻瘟病的防治效果，降低用药量，延长使用寿命。