稻瘟病抗性基因对安徽省稻瘟病菌种群抗性的影响

张海珊 杨雪 章东方 严丹侃 顾江涛 张爱芳

（安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，合肥230031；*通讯作者：aifangz＠163.com）

稻瘟病是水稻生产上具有毁灭性的严重病害之一，全球的水稻产区几乎都受到不同程度的为害，每年因稻瘟病导致的水稻减产占11%～30%[1-4]，给水稻生产造成了巨大的经济损失。实践证明，培育和种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方式[2-6]。但稻瘟病菌的种群结构及生理小种具有丰富的多样性，在不同水稻产区甚至同一水稻产区的不同年份，稻瘟病菌的种群结构及生理小种也会发生变化。稻瘟病菌的遗传多样性是造成稻瘟病难以控制的主要原因[7]。因此，筛选具有广谱抗性的稻瘟病抗病基因，进而有针对性地开展抗性育种对稻瘟病的防控意义重大。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，水稻基因组学研究亦进展迅猛，目前至少已有69个稻瘟病抗病位点被定位和鉴定，已报道的主效抗性基因超过100 个[7]，28 个抗病基因被陆续挖掘出来[2，8-31]，新的抗稻瘟病基因仍在被不断的挖掘[32]，其中的23个抗病基因为一类编码NBS-LRR蛋白（Nucleotide-binding siteleucine rich repeats）的主效抗稻瘟病基因，这些抗病基因介导的抗性表现强，育种可操作性强、效果明显，开展主效抗性基因的鉴定及其应用研究的也比较多，为快速、准确地鉴定不同水稻资源的抗稻瘟病基因型提供了便利[3-4，33-42]。本研究利用10个水稻抗稻瘟病单基因品系，比较了安徽地区稻瘟病菌的致病力，筛选出对安徽稻瘟病菌群体具有较好抗性的抗病基因；测定了201份水稻品种对稻瘟病的抗性水平及其所携带的抗性基因的抗性特点，以期为安徽水稻品种的合理布局和水稻抗稻瘟病育种工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试水稻品种

本试验中所有供试水稻鉴别品种、水稻抗稻瘟病单基因品系由安徽省农业科学院保存；201份供试品种是长江中下游水稻区试品种，由中国水稻研究所提供。

1.2 稻瘟病菌的分离和鉴定

采集安徽省稻瘟病常发区金寨县、潜山县、休宁县等地的穗颈瘟病样，并进行单孢分离纯化得到稻瘟病菌株。

1.3 稻瘟病菌的毒力分析

选用10个不同水稻抗稻瘟病单基因品系（Pia、Pii、Piks、Pik、Pikp、Pizt、Pita、Pib、Pi9、Pita2）对安徽地区的108个稻瘟病菌株的致病力进行测定。

1.3.1 育苗

水稻种子浸种催芽处理2 d，催芽后的种子播种在育秧盘（60 cm×30 cm×4 cm）中，每个育秧盘2行，每行5穴。每个品种播1穴，每穴播种10粒左右。播种后盖土并置于网室内保湿育秧。接种前3～5 d酌施氮肥，保持稻苗嫩绿，待长到 3叶1心时接种稻瘟病菌，每个处理重复3次。

1.3.2 稻瘟病菌孢子悬浮液制备及接种

挑取稻瘟菌菌块移到水稻秸秆培养基（玉米粉20 g，水稻秸秆 40 g，琼脂 20 g，水 1 L，121 ℃，灭菌 20 min）上，25℃下培养7 d，然后放在黑光灯下连续光照培养3 d，待产生孢子后，用无菌水洗下培养基表面的孢子，并用纱布滤掉菌丝，孢子液浓度约为2×105个孢子/mL，接种量以所有叶片上布满孢子液为限。接种后置于25℃～28℃的温室内，遮光保湿24～48 h，然后去除遮光条件，并定时喷雾保湿。

1.3.3 抗性频率调查统计

调查时间为接种后7 d。抗性频率（RF）=（抗性菌株数/供试菌株总数）×100%。

1.4 水稻品种抗性水平和抗性基因的关系

1.4.1 不同水稻品种中抗性基因的扩增

采用 DNeasy Plant Maxi Kit（Qiagen）提取 201 份供试水稻品种的基因组DNA，并保存于-20℃备用。利用已公布的抗稻瘟病基因Pi9基因序列设计了特异性引 物 （Pi9-1F：TGCCCAACCTTTACCCACTGTA；Pi9-1R：AACATGAGTAGAAACAAATTAGTTTG），用Pi9引物对（由上海生工生物工程技术有限公司合成）进行PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，34个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4.2 不同水稻品种抗性水平鉴定

采用苗期人工喷雾接种的鉴定方法，选择安徽省代表性菌株3～5个混合喷雾接种，对201份供试水稻品种进行田间抗性鉴定，以丽江新团黑谷为感病对照，接种后7～10 d，苗瘟充分发病后（感病对照品种发病达7级或以上）进行调查，参照国际统一标准调查发病情况：0级为高抗（HR）、1级为抗病（R）、3级为中抗（MR），5级为中感（MS）、7级为感病（S）、9级为高感（HS）。

2 结果与分析

2.1 稻瘟病菌的分离与鉴定

从安徽省不同水稻产区的不同水稻品种上采集了180余份稻瘟病样品，通过单孢分离纯化，共获得108株稻瘟病菌株。

2.2 安徽稻瘟病菌群体的致病力分析

通过测定108株稻瘟病菌株对10个不同单基因系的致病力（图1），发现含有Pi9、Pik和Pizt的单基因系对安徽地区的稻瘟病菌株整体具有较高的抗性水平，抗性频率分别为66%、60%和54%，其中以Pi9基因抗性最强，说明安徽地区的稻瘟病菌对含有Pi9基因的品种致病力弱，筛选或培育具有Pi9抗性基因的水稻品种适宜在安徽稻区推广。其次是含有Pii、Pikp、Pitz和Pita2的单基因系，对部分菌株有抗性，在安徽地区有一定的利用价值。含有Pia、Piks和Pib的单基因系抗性频率低，利用价值不高。试验中发现有少部分稻瘟病菌株具有强致病力，对大部分的抗性基因同时具有毒力。

图1 108株稻瘟病菌株对10个不同单基因系的致病力测定结果

表1 供试水稻品种的稻瘟病抗性评价

2.3 水稻品种抗稻瘟病基因Pi9的检测

用Pi9引物对Pi9-1F/Pi9-1R对201份供试水稻品种进行PCR扩增及电泳检测。从201份水稻品种中检测到67个品种携带Pi9抗病基因，比例为33.33%。

对201份水稻品种进行田间稻瘟病抗性鉴定的结果（表1）表明，携带Pi9抗病基因的水稻品种发病程度为感或高感的共计7份，仅占3.49%；不携带Pi9抗病基因的水稻品种发病程度为感或高感的共计70份，占34.83%。说明Pi9基因在水稻品种的稻瘟病抗性中起重要作用。

3 结论与讨论

目前水稻稻瘟病主要是利用化学农药进行防治，容易造成环境污染，且增加了生产成本，而推广抗稻瘟病品种是防治稻瘟病经济且有效的预防措施，因此筛选抗稻瘟病基因，选育抗病品种可能是有效预防稻瘟病流行的重要手段。本研究所用的稻瘟病菌株均采自安徽省水稻主要产区的田间自然发病的穗颈瘟样本，较好反映了安徽省稻瘟病菌的群体情况，有助于进行稻瘟病生理小种的毒力测定，以及筛选广谱的抗稻瘟病基因。

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，通过分子技术将多个抗病基因聚合到一个品种上，培育出多抗品种普遍认为是可行的。目前的多数研究表明，水稻品种的抗病性与其抗病基因的种类和数量均有关，因此加强对抗稻瘟病种质资源和抗性基因的挖掘，寻找更加广谱的抗稻瘟病基因，将多个效果好的抗稻瘟病基因同时导入到综合性状优良的水稻品种中，可快速提升水稻抗稻瘟病的水平。亦有研究表明，随着抗性基因数量的增加，水稻品种的抗病性也呈上升趋势[31，44-45]。因此，在选择抗病亲本时，须针对同一生态区域内的生理小种，鉴定对其抵抗力较强的基因类型，在育种过程中聚合其中2个或多个抗病基因，才能提高水稻品种的稻瘟病抗性水平[46]。本研究利用10个常用的主效抗病基因的单基因品系，对安徽地区的稻瘟病菌群体进行了毒力测定，可以直接高效的筛选出对安徽省稻瘟病菌具有广谱抗性的抗稻瘟病基因，研究结果发现，Pi9基因对安徽省稻瘟病菌的抗性较强，且田间稻瘟病抗性鉴定的表现好，因此，在安徽稻区适宜选育及推广含有Pi9及其他多个抗稻瘟病基因的水稻品种。此外，我们在试验过程中也发现了部分稻瘟病菌株，其对供试的大部分抗性基因同时具有毒力，其中包括Pi9基因。这一现象表明在今后的品种选育和推广中，应时刻关注Pi9等抗性基因的抗性水平与生理小种变化之间的关系，合理利用抗性基因，以预防因稻瘟病种群变化而导致品种抗性丧失带来的损失。