切花月季弯梗现象的形态解剖学观察

石力匀,王 政，何松林,2，李玲达，王胜楠,孙 畅,杨 博

(1.河南农业大学 林学院，河南 郑州 450000； 2.河南科技学院 园艺园林学院，河南 新乡453000；3.河南鸡公山国家级自然保护区管理局，河南 信阳 464133)

月季(Rosahybrida)是蔷薇科蔷薇属植物，被誉为花中皇后。因其是日中性植物(Day-neutral plant)，开花受自身发育状态的控制，在适宜的温度下可四季开花，成为我国重要的切花品种和经济花卉之一[1]。月季的生长发育是一个复杂的形态发生与自身生理生化调节的过程，受许多因素的影响，除了本身的营养状况外，外部环境对其生长发育也有着重要影响[2]。不适宜的生长环境如高温、高湿等会引起月季植株发育异常，导致花朵畸形，引发切花月季的生理性病害，严重影响其观赏品质及商品价值。

植物的外部形态和内部细胞结构的变化是植株生理生化变化的反映，植物体内的激素变化、遗传特性和环境影响往往相互作用，从而引起形态发生上的变化。弯梗现象(Bent peduncle phenomenon,BBP)是月季花朵常见的生理性畸形之一，不同于月季花朵采后由于水分胁迫引起的弯颈现象，弯梗现象出现在植株的生长过程中，子房下方的花梗朝一侧弯曲，并且导致花不能正常开放或花姿不整，影响切花的观赏价值和产量[3]。因此，研究弯梗现象引起的内外部形态变化可进一步揭示切花月季在各种因素影响下形态发生和结构变化的原因和机制。本研究以切花月季品种卡罗拉(Rosahybrida‘Carolla’)为试验材料，观察其在不同季节生长温度下的弯梗率，对比弯梗植株及正常植株的生长形态和内部解剖形态，以期为研究月季弯梗现象的发生原因、形成机制以及提高切花月季的栽培品质提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 试验设置与材料

2017年10月—2018年11月，在河南省濮阳市源龙乡切花月季温室设置无线测温系统(CWT-04,HEBIDA，中国)，监测温室的温度，并于此期间每月1次，对切花月季卡罗拉的弯梗率进行统计，弯梗率=弯梗植株/总植株×100%。

切花月季卡罗拉于2018年9月采自河南省濮阳市源龙乡切花月季温室。选取健康生长的正常植株及弯梗畸形的植株各40株，30株用于形态特征观察，10株在拍照后切取适宜大小的组织块置于戊二醛固定液中固定保存。

1.2 观察方法

1.2.1 弯梗外部形态特征观察 随机选取月季正常及弯梗植株各30株，萼片的名称按照COOK[4]定义的萼片顺序来编号。观察弯梗的方向、1号萼片变形的形态、萼瓣的形态等，并对正常植株和弯梗植株的形态拍照记录，使用游标卡尺测量花梗高度、1号萼片下落距离、花朵宽度、花朵高度、子房高度、子房宽度，使用YMJ-B型叶面积测试仪测量1号萼片的面积以及用量角器测量弯梗植株的弯梗角度。

1.2.2 扫描电镜样品的制备与观察 选取正常及弯梗植株的1号萼片、萼瓣、花瓣、子房下方1～2 cm处的花梗等，分别放于预冷的载玻片上，用刀片切成边长小于5 mm、厚小于2 mm的小块，快速投入用 0.1 mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)配制的2.5%戊二醛溶液中于4°保存固定。然后用 pH值7.2的PBS冲洗3次，每次30 min，依次用 30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水各3次，每次20 min。使用3∶1、1∶1、1∶3的乙醇∶乙酸异戊酯(体积比)各置换1次，每次15 min，用 Hitachi HCP-2型临界点干燥器进行干燥，喷金后用SEM S-3400N型扫描电镜(Hitachi,东京,日本)进行观察拍照。

1.3 数据处理

外部形态统计共30个重复，花梗的细胞形态共10个重复，所有数据采用平均值，并采用Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。数据统计分析采用SAS (Version 9.3,SAS Institute Inc.,Cary,北卡罗来纳州,美国)，作图采用Sigmaplot 14.0(Systat Software Inc.,圣何塞,美国) 进行。

2 结果与分析

2.1 不同季节月季弯梗率统计

从图1可以看出，月季的弯梗现象周年均可发生，弯梗率的变化趋势与温室温度的变化趋势趋于一致。随着温室温度的升高，弯梗率呈现增长的趋势。其中，6—8月3个月的弯梗率均超过20%，显著高出其他月份(P<0.05)。6月温室最高温度大于30 ℃的有26 d，7月有28 d，8月有24 d。由此可知，夏季高温是诱导切花月季卡罗拉弯梗现象发生的重要因素，这也与ZACCAI等[3]、SEO等[5]发现的当温度高于30 ℃时弯梗现象发生概率显著增加的现象一致。

2.2 月季弯梗现象外部形态比较

2.2.1 月季弯梗现象外部形态观察 月季的弯梗畸形现象如表1、图2所示，与正常植株相比，弯梗植株的花梗长度较短，子房下方0.5～2.0 cm处的花梗向一侧弯曲(图2B-1)，形成了5°～90°的夹角(平均36.22°)。同时，弯曲部分的茎发育变形，形成扁平的花梗(图2B-2)。COOK[4]将月季的5片萼片按照形态进行了定义，正常植株的1、2号萼片的两边皆有羽状裂片，3号萼片仅一边有羽状裂片，而 4、5号萼片两边则是光滑的(图3A)。由表1可知，弯梗植株的1号萼片相较于其他 4 片萼片下移了平均0.63 cm，与正常植株的1号萼片相比，萼片面积显著增大2.8倍，并发生一定比例的叶变(Phyllody)现象，形成了单叶、3小叶、5小叶等不同的形态(图4)。同时，原本1号萼片出现的位置被半瓣半萼或者萼瓣状(Sepalody)的器官替代，其特点是萼片和花瓣状的结构同时出现在同一瓣器官上(图3B—H)。

图1 温室周年温度变化(A)及切花月季卡罗拉弯梗率变化(B)(2017-10—2018-11)Fig.1 Seasonal change in temperature(A) and bent peduncle rate(B) of cut rose Carolla(2017-10—2018-11)

表1 切花月季卡罗拉正常植株与弯梗植株的生长形态比较Tab.1 Comparison of growth characteristics between normal flower and BBP flower of cut rose Carolla

图2 切花月季卡罗拉正常植株(A)和弯梗植株(B)Fig.2 Normal flower(A) and BBP flower(B) of cut rose Carolla

2.2.2 弯梗现象引起的萼片异位表达情况 同时发现，1号萼片的叶变引发了其他4片萼片及花器官的异位表达。一种是其他4片萼片大概率异位(60%以上)呈逆时针方向，如60%的2号萼片变成4号萼片(图5A)，60%的3号萼片变成5号萼片(图5B)，80%的4号萼片变成3号萼片(图5C)，而70%的5号萼片变成2号萼片(图5D)。一种是其他4片萼片一定概率异位(10%～30%)，整体为不定向性，如2号萼片可能会变成1、5号萼片，3号萼片变成2号萼片，4号萼片变成5号萼片，5号萼片变成4号萼片。

图3 切花月季卡罗拉正常植株(A)与弯梗植株(B—H)萼片的形态比较Fig.3 Comparison of sepal patterns between normal flower(A) and BBP flower(B—H) of cut rose Carolla

图4 切花月季卡罗拉弯梗植株萼片的异位表达形态Fig.4 The morphology of ectopic expression in BBP flower of cut rose Carolla

A:2号萼片变成4号萼片比例；B:3号萼片变成5号萼片比例；C:4号萼片变成3号萼片比例；D:5号萼片变成2号萼片比例A:The rate of No.2 sepal transformed into No.4 sepal;B:The rate of No.3 sepal transformed into No.5 sepal;C:The rate of No.4 sepal transformed into No.3 sepal;D:The rate of No.5 sepal transformed into No.2 sepal图5 切花月季卡罗拉1号萼片异位表达变化率Fig.5 The rate of ectopic expression on sepal 1 in BBP flower of cut rose Carolla

2.2.3 弯梗现象引起的花发育变化情况 弯曲的花梗严重影响了花朵的发育，弯梗植株的花瓣数量较正常植株减少19.51%，花朵鲜质量减少34.01%，花朵宽度及花高也显著降低，分别减少14.70%和21.47%。同时，弯梗植株子房形态也发生了明显变化，子房的宽度显著增大，但高度显著降低，宽高比较正常植株增大1.73倍，且子房质量变化不大(表2)。

表2 切花月季卡罗拉正常植株与弯梗植株的花朵与子房形态比较Tab.2 Comparison of flower bud and ovary characteristics between normal flower and BBP flower of cut rose ‘Carolla’

2.3 月季弯梗现象解剖结构观察

正常植株的花瓣上表皮的细胞向外呈五边形或六边形半球状突起，排列紧密，间隙小，突起基本在一个水平面上，突起表面由条纹状皱褶构成(图6A-1)，花瓣的下表皮则由无规则的皱褶和大小不一的腔构成(图6A-2)[6]。图6B是弯梗植株中替代1号萼片出现的半瓣半萼组织，萼瓣的上表皮细胞也向外突起，但弯梗植株半球状的突起皱褶与正常花瓣的细胞突起相比明显增加，且突起不在一个水平面上，从花瓣向萼片过渡的过程中突起逐渐平缓，完全变成平整的褶皱并出现毛状组织(图6B-1)。萼瓣的下表皮也出现了类似的过渡现象，花瓣部分的褶皱消失，只有紧邻的腔结构，且腔结构逐渐模糊，出现饱满的圆型毛状组织(图6B-2)。正常植株的1号萼片的上下表皮细胞结构如图6C所示，萼片上表皮细胞呈不规则形状，并可见有少量气孔分布(图6C-1)，而萼片的下表皮布满毛状组织，与萼瓣的下表皮相比，毛状组织密度显著增加，且为扁平状(图6C-2)。而弯梗植株的1号萼片发生了叶变并下落，发生叶变的1号萼片上表皮细胞皱起且无气孔分布(图6D-1)，而下表皮细胞分布有密集的气孔，且气孔密度显著大于正常植株的1号萼片(图6D-2)，细胞特征与月季的叶片相近[7-8]。

A-1:正常植株花瓣上表皮;A-2:正常植株花瓣下表皮;B-1:弯梗植株萼瓣上表皮;B-2:弯梗植株萼瓣下表皮;C-1:正常植株1号萼片上表皮;C-2:正常植株下表皮;D-1:弯梗植株叶变的1号萼片上表皮;D-2:弯梗植株叶变的1号萼片下表皮

与正常植株相比，弯梗植株子房下方0.5～2.0 cm处的花梗部分发生弯曲，圆柱形花梗变得扁平。弯梗植株与正常植株花梗的内部结构也有显著的差异，弯梗植株弯梗处的韧皮层明显增厚，为8.78 mm，是正常植株韧皮层的3.7倍(表3)。同时该弯梗处的维管束变高，比正常植株的维管束高出49.5%，由扁圆形变为近圆形。弯梗植株的厚壁组织细胞显著增大且数量增加，1号萼片下落侧的厚角组织内侧多出了一块高约4 mm、宽约7 mm排列紧密的细小细胞，增加的细胞组织造成了花梗向弯曲侧突起(图7)，是导致花梗呈扁平状的原因。

表3 切花月季卡罗拉正常植株与弯梗植株的花梗细胞形态比较Tab.3 Comparison of cells characteristics between normal flower and BBP flower of cut rose Carolla

图7 切花月季卡罗拉正常植株(A)和弯梗植株(B)的花梗横切形态比较Fig.7 Comparison of transverse section of normal flower(A) and BBP flower(B) peduncle of cut rose Carolla

3 结论与讨论

月季的成花是一个复杂的多层次、多元化反应过程[9]。月季生长期的温度对花芽的分化与生长发育都有一定的影响，进而影响了其外观品质及商业价值。月季适宜生长温度为日平均温度10～25 ℃，当生长温度低于5 ℃，或超过30 ℃后会处于休眠或半休眠状态，花芽停止分化，较难生产出枝条长度、花苞大小符合要求的高品质花枝[10]。目前切花月季生产可实现周年供应，但夏季高温严重的影响了植株正常生长，严重时会导致月季出现变叶病[11-12]和弯梗[3,5]等畸形现象。本研究发现，切花月季卡罗拉在夏季6—8月的高温环境下弯梗率显著提高，由此可见，高温是导致月季弯梗现象发生的重要环境诱因。

本研究发现，月季弯梗植株的花器官表达出现叶变、异位和萼瓣化现象。在叶变方面，其1号萼片发生叶变现象，萼片面积增大，上下表皮细胞与正常植株1号萼片的细胞有明显差异，下表皮的毛状结构消失，出现了密集的气孔，与叶片的细胞结构相近，并形成了形态不同的小叶；1号萼片的着生位置也发生了变化，正常月季植株中完整的合萼在弯梗畸形发生时，1号萼片会脱离其他4瓣萼片，发生高度不等的下落现象。同时，该现象可引发60%以上概率的其他4个萼片逆时针的异位表达，而1号萼片本应着生的位置则被萼瓣状的器官替代，同时出现萼片和花瓣2种组织结构，其萼瓣的上表皮细胞呈现出从突起到平坦的过程，褶皱显著增加，下表皮则出现了与萼片相同的毛状组织。COOK[4]和BOND[13]分别在1926年和1945年报道过这种萼片叶变的现象，认为激素在月季植株从营养生长到生殖生长过程中的不均衡分布是萼片叶变的主要原因，同时引发了花瓣的萼瓣化。月季中的另一种常见的生理畸形变叶病也会出现花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊等花器官全都被含有叶绿素和气孔的类似叶片的结构所替代的现象[14]，高温是引起变叶病的重要原因之一，高温引发了月季植株体内细胞分裂素含量的分布不均，导致了花器官的叶变[11,15-16]。而花瓣中出现萼片结构的萼瓣现象被报道也与温度与激素相关[17-19]。萼片对植物的生长和发育有着重要作用，萼片的不正常发育会导致月季花朵的畸形[20-21]。本研究发现，高温条件引起月季弯梗植株的萼片出现异位表达现象，并进一步导致花朵变小，花瓣明显减少。

花梗是月季花器官与茎的连接部，起到支撑花器官和调节水分传输的作用，在植株的生长和花器官的发育过程中扮演着重要的角色[22]，花梗部与茎部的发育结构不同，茎部具有发育更为完善的环状木质部，植物管细胞的直径较大，而花梗维管组织的发育较弱，有着较为不成熟的纤维素，维管组织呈不连续的束状，细胞较茎部显著减少并变小[23-24]。这些组织结构上的差异使得花梗部更易受到生长环境及其他因素的影响[25]。生长素与赤霉素会影响花梗部的酶活性进而影响花梗部木质素与纤维素的产生[26-27]。月季的花器官同样是生长素和赤霉素的来源[28]，有研究显示，花器官中的激素也参与了调节花梗部维管组织的分生与发育[29]。同时，当植株受到胁迫时，植株会放弃花器官的发育来保护整株植株的生长[21]。本试验中月季正常植株与弯梗植株的花梗部也有显著的不同，弯梗植株的维管束发生变形，更接近圆形，同时韧皮层增厚，厚壁组织细胞显著增大且数量增加，1号萼片侧的厚角组织内侧则增长了块状的细胞组织，内部的细胞形态变化使得弯梗植株的花梗在外部形态上呈扁平状，并朝1号萼片下落侧呈5°～90°的夹角。因此，本研究推测，月季在受到高温胁迫时，花器官与花梗相互制约可能导致调节激素浓度分布时出现了不均匀现象，进而导致了弯梗畸形现象的发生。有研究表明，如果在月季正常植株的花梗部注射生长素，会出现跟畸形花类似的弯折现象，花梗会朝与注射侧相反的方向弯折，然而这种现象是临时性的，70%的弯折梗会在随后的几日恢复正常[3]；同时发现，正常花中的IAA含量在花芽分化前期较高，随着植株的发育IAA含量逐渐降低，而弯梗植株中IAA含量始终维持在较高的水平[5]。因此，IAA参与了弯梗现象的发生。植物花器官的发育受到MADS-box家族基因的调控[30]。本研究发现，弯梗过程中1号萼片的叶变和其他萼片组出现异位表达现象，这种畸形现象或许与 A 类、B 类功能基因表达异常有关，其弯梗现象的激素及分子调控等方面机制有待进一步解析。