抑制Livin的表达对喉癌细胞HEP-2增殖的影响

焦江琴 李 捷 朱丽英

喉癌是来源于喉黏膜上皮的恶性肿瘤，是头颈部常见的恶性肿瘤，当前在我国的发病率显著上升[1]。手术为该病的主要治疗方法，但是很多患者在术后容易出现复发现象，进而导致患者死亡[2]。迁移是喉癌瘤致死的主要原因，因此深入研究喉癌迁移的分子机制，并筛选有效的治疗靶标，对改善患者的预后具有重要价值[3-4]。喉癌发生与发展常与上皮细胞间粘附连接丧失、细胞极性形成等过程相关，导致其迁移的能力得到增强[5]。Livin具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的功能，一般在恶性肿瘤中其表达显著上调，Livin与多种Caspase结合并相互作用[6]。本文具体探讨了抑制Livin的表达对喉癌细胞HEP-2增殖的影响，以明确Livin的作用效果与机制。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

喉癌细胞系HEP-2(购自中国医学科学院基础医学研究所)，选择含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于含5% CO2、37 ℃培养箱中培养；Livin siRNA重组腺病毒(Ad-si Livin)由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。

1.2 细胞分组与处理

将细胞分为三组，实验组：感染Livin-siRNA重组腺病毒的HEP-2细胞；阴性对照组：感染Livin-control重组腺病毒的HEP-2细胞；空白对照组：未感染重组腺病毒的HEP-2细胞。取生长状态良好的对数期HEP-2细胞，消化后按5000个/孔接种于96孔板中，培养24 h，每个稀释度设置3个复孔；设置感染复数，吸尽原有培养液，按病毒滴度梯度加入重组腺病毒Ad-GFP感染HEP-2细胞。

1.3 qRT-PCR检测Livin mRNA表达

取感染后48 h与72 h的细胞，采用Trizol法提取总RNA，OD260/OD280结果在1.8～2.0 之间，逆转录后cDNA后进行qRT-PCR反应，反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，总共40 个循环，检测UHRF1相对表达量。GAPDH引物：正向引物 5“-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3”反向引物 5“-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3”Livin引物：正向引物 5“-GGCTCTCAACTGCTTTGCTC-3”

反向引物 5“-TGCTATTCTTGCCACCCTTG-3”。

1.4 MTT检测细胞增殖

取处于对数生长期的HEP-2细胞，接种到96 孔板，MTT增殖检测试剂盒(购自Abcam中国)检测HEP-2细胞增殖情况，具体过程按照试剂盒说明进行操作。根据结果绘制细胞生长曲线，计算细胞增殖情况，细胞增殖抑制率(%)=[(A对照组-A实验组)/A对照组]×100%。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

分别于感染48 h和72 h后收集细胞，洗涤，采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(购自Sigma-Aldrich)，采用双变量流式细胞术检测细胞凋亡情况，Cell Quest软件分析并计算细胞凋亡率。

1.6 Transwell测细胞迁移

分别于感染48 h和72 h后收集细胞，消化后重悬，以200 μl/孔，10×104/孔接种于 Transwell上室。培养24 h后取出小室固定，结晶紫溶液染色后倒置显微镜下观察并计算细胞迁移数。

上述每个实验都重复3次，取平均值。

1.7 Western blot检测蛋白表达

收集感染48 h后的细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒(购自Sigma-Aldrich)说明书进行蛋白定量，40 μg/孔上样，10%SDS-PAGE分离胶电泳。电泳结束后采用湿转法将蛋白转印到PVDF膜，TBST清洗PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭4 h，滴加一抗(Livin抗体、Caspase-3抗体、β-actin抗体)，4 ℃孵育过夜，加入二抗 37 ℃孵育 1 h，化学发光试剂ECM进行曝光定影。

1.8 统计方法

2 结果

2.1 Livin mRNA表达情况

感染48 h与72 h后，实验组Livin mRNA相对表达量均较空白对照组和阴性对照组显著降低(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与感染48 h相比，实验组感染72 h后UHRF1 mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，其余两组两个时间点则均无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 感染后不同时间点的UHRF1 mRNA相对表达情况对比

2.2 细胞增殖对比

感染48 h与72 h后，实验组的细胞增殖抑制率均较空白对照组和阴性对照组显著增高(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与感染48 h相比，实验组感染72 h后细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05)，其余两组两个时间点则无显著差异(P>0.05)，见表2。

表2 感染后不同时间点细胞增殖抑制率对比

2.3 细胞凋亡对比

感染48 h与72 h后，实验组细胞凋亡率均较空白对照组和阴性对照组显著增高(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与感染48 h相比，实验组感染72 h后细胞凋亡率显著增高(P<0.05)，其余两组两个时间点则无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 感染后不同时间点的细胞凋亡对比

2.4 细胞迁移对比

感染48 h与72 h后，实验组细胞迁移数目均较空白对照组和阴性对照组显著降低(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。与感染48 h相比，实验组感染72 h后细胞迁移数目显著降低(P<0.05)，其余两组两个时间点则无显著差异(P>0.05)。见表4。

表4 感染后不同时间点的细胞迁移数目对比个)

2.5 Livin和Caspase-3蛋白表达对比

感染48 h后，实验组Livin和Caspase-3相对表达量较空白对照组和阴性对照组显著增加。见图1。

图1 三组感染48 h后Livin、Caspase-3蛋白表达对比

3 讨论

喉癌的发病与病毒、环境、遗传等因素有关，其起病隐匿，因此多住患者就诊时已处于中晚期，同时中晚期喉癌手术的复杂性及术后并发症等的影响，导致生存率不高，且生活质量明显下降[7]。Livin表达于人类大多数恶性肿瘤中，有研究显示恶性肿瘤组织中Livin呈高表达，可抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进其异常增殖和恶性分化[8]。Livin在喉鳞癌组织和血液中高表达，且与喉癌淋巴结迁移、临床分期密切相关。增殖增加与凋亡减少是恶性肿瘤的基本特征，也是其复发和致死的主要原因[9]。本研究显示感染后48 h与72 h，与阴性对照组和空白对照组相比，实验组的细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著增加，表明可通过抑制Livin的表达从而使得喉癌细胞增殖收到抑制，并促进其凋亡。

喉癌的发生和发展是极其复杂的病变过程，目前无法对其重要因素进行早期准确预测，因此该疾病大多数患者预后较差[10]。本研究显示感染后48 h与72 h，与阴性对照组与空白对照组相比，实验组的细胞迁移数目显著降低，表明抑制Livin的表达能抑制喉癌细胞的迁移。当前也有研究显示Livin可能参与恶性肿瘤细胞增殖以及诱导机体产生体液免疫与细胞免疫应答等过程[11]。

Livin和Caspase-3均作为凋亡通路中的重要作用蛋白，在细胞癌变过程中相互作用关系。其中Caspase-3作为Caspase家族中的一员，是细胞凋亡过程中的起关键作用的蛋白酶，其作为凋亡的执行者，可通过介导信号传导途径导致细胞凋亡[12]。Livin可与Caspase-3结合并相互作用，使得后者在细胞凋亡过程中起的关键作用增强，从而对于细胞凋亡产生影响[13]。并且Caspase-3的表达下调与分化程度、临床分期和恶性肿瘤浸润迁移等生物学行为特征密切相关，并与肿瘤患者预后密切相关[14]。本研究显示感染后48h，与阴性对照组与空白对照组相比，实验组的Livin、Caspase-3相对表达量显著增加。当前也有研究显示通过沉默Livin的表达可影响Rb的磷酸化，抑制细胞的增殖[15]。

总之，抑制Livin的表达能能激活喉癌细胞的Caspase-3通路，从而抑制喉癌细胞HEP-2增殖与迁移，促进细胞凋亡。