miR-98和let-7bb抑制乳腺癌细胞的增殖影响

张志强 王晓舟 马 怡 郑 爽 韩彧佳 赫丽杰

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，是1个由多基因变异、表观遗传改变、多个蛋白结构或功能异化相作用而导致的疾病[1]。MiRNA是一类小分子非编码RNA，家族众多，功能各异，有研究报道，let-7a可抑制肺癌细胞的活性[2]，miR-373可促进乳腺癌细胞的转移[3]，而miR-98能抑制乳腺癌细胞的转移[4]。我们拟通过收集乳腺癌患者和健康人对照的临床标本，检测miR-98和let-7b的表达，并检测其对乳腺癌细胞的增殖的影响，以期为乳腺癌的发病和进展的病理机制提供新的视野。

1 材料与方法

1.1 临床标本

收集2018年1月至12月期间在辽宁省人民医院就诊的乳腺癌患者，收集其乳腺癌组织和癌旁组织，健康人乳腺组织标本来自于乳腺癌病理检查阴性的健康人。乳腺癌患者58例，平均年龄为(46.7±19.3)岁，健康人对照67例，平均年龄(39.8±20.5)岁。

1.2 试剂与细胞

SKBR3细胞购自于ATCC(美国)，DMEM 1640培养基购自Gibco(美国)，BSA购自Thermo(美国)，MTT购自Sigma(美国)，miR-98和let-7b的mimic和inhibitor均购自Thermo(美国)，RT-PCR所用的反转录试剂盒、SYBR-GREEN试剂盒均购自TOYOBO(日本)。

1.3 RT-PCR法检测miRNA在临床标本中的表达

将收集的乳腺组织标本剪碎，加入液氮研磨，制成单细胞悬液。用TRIzol法抽提总RNA，紫外分光光度法进行定量，用反转录试剂盒获得cDNA，根据SYBR Green试剂盒进行RT-PCR实验，用2-ΔΔct法分析数据。引物设计为miR-98，Pr：5'-GGGGTGAGGTAGTAAGTTGT-3'，Pf：5'-TGGGTGTCGTGGAGTC-3'；let-7b，5'-UUG GUG UGU UGG AUG AUG GAG U-3'[5]，GAPDH，Pr：5'-TGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3' Pf：5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGGC-3'，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4 MTT检测miR-98和let-7b对细胞系增殖的影响

在6孔板中培养SKBR3细胞，至状态良好、密度约60%时加入miR-98和let-7b mimic或inhibitor，继续培养一段时间，每孔加入5 mg/l的MTT溶液20 μl，培养4 h后吸尽培养液，加入PBS洗3次，吸尽余液，加入150 μl DMSO，在37 ℃恒温摇床上温和震荡10 min，上酶联免疫检测仪，570 nm波长处读取OD值。

1.5 统计学分析

应用Graphpad prism 6对数据进行统计分析，两组之间均数的比较用t检验，多组均数之间的比较用方差分析。以α=0.05为检验水准，文中图表上以*表示P<0.05。

2 结果

2.1 miR-98和let-7b在乳腺癌标本中表达下调

将收集的临床标本分为3组，分别为健康人对照(n=67)，癌旁组织(n=57)和癌组织(n=57)，RT-PCR检测收集的临床标本中miR-98和let-7b的表达水平，结果显示，乳腺癌癌组织中miR-98和let-7b的表达水平显著低于癌旁组织和健康人对照，见图1A和图1B。

图1 RT-PCR检测标本中miR-98(A)和let-7b(B)的表达

2.2 miR-98和let-7b抑制乳腺癌细胞系增殖

培养SKBR3细胞，分别加入miR-98和let-7b的 mimic或inhibitor，在24 h、36 h、48 h、60 h和72 h后MTT检测细胞增殖的水平。结果显示，在加入miR-98或let-7b的mimic 72 h后，细胞增殖水平显著降低，而在加入miR-98或let-7b的inhibitor 72 h后细胞增殖水平显著增高。这表明，miR-98和let-7b均能抑制SKBR3细胞增殖，见图2。

图2 MTT检测miR-98(A)和 let-7b(B)对SKBR3细胞增殖的影响

3 讨论

乳腺癌确切病因和发病机制尚未明确，有研究报道，BRCA、PTEN、TP53等基因突变会导致乳腺癌发病风险增加[6]，基因甲基化等表观遗传改变会增加患乳腺癌的几率[7]，miRNA[8]、EGFR[9]突变等可参与乳腺癌细胞的增殖和迁移。导致乳腺癌发病的因素众多，而促进乳腺癌细胞增殖和迁移的因素则是导致乳腺癌发病和进展的关键因素。

miRNA在肿瘤的增殖和迁移中发挥了重要的调节作用，有研究报道，miR-98可抑制结肠癌细胞摄取糖分和糖酵解作用，并抑制其增殖[10]。miR-98通过下调TALL4的表达来抑制小细胞肺癌的进展[11]，血清miR-98处于低水平被认为是小细胞肺癌不良预后的指标[12]。miR-98可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[13]，这与我们的研究基本一致。还有研究报道，miR-98可抑制B细胞产生IL-10来抑制肿瘤[14]，而IL-10是免疫负向调节因子，这表明miR-98还可参与抗肿瘤的免疫调节。

let-7b在大多数肿瘤中都表达下调[15]，并抑制肿瘤[14]。研究报道，let-7b可通过调节IN1来抑制胃癌的恶性进展[16]，let-7b可通过调节组蛋白的泛素化来抑制细胞的迁移[17]。let-7b可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]，与我们的研究基本相符。let-7b可调节巨噬细胞的极化，并促进肿瘤相关的巨噬细胞的迁移能力[19]，表明let-7b也可参与抗肿瘤的免疫调节。

综上所述，我们的研究表明，在乳腺癌中，miR-98和let-7b的表达下调，二者可抑制乳腺癌细胞的增殖。这表明，miR-98和let-7b有作为乳腺癌治疗靶点的潜力。我们下一步将研究miR-98和 let-7b抑制增殖的靶蛋白和具体的分子生物学机制，并在动物模型上进一步验证我们的研究结论。