大鼠胃黏膜组织Syk、Survivin蛋白、P53及AMP-18 mRNA表达和胃癌病变程度的相关性

吴 江 吴 涛 陈 鹏 庞 澜 阿里木江·阿不都热合曼 马秀英 包 辉 朱勇荷 岳跃明 张荔霜

胃癌作为消化道常见的恶性肿瘤疾病，病死率逐年递增，已成为恶性肿瘤死亡的第二主要病因[1]。既往研究指出，胃癌的发生发展与胃黏膜组织上皮细胞的增殖、凋亡及原癌基因的激活密切相关[2]。临床上，胃癌的预防及治疗目标是减轻黏膜病变、抑制细胞凋亡并修复受损细胞，从而逆转癌变进展[3]。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)作为一种候选抑癌基因，参与了机体免疫反应，对细胞的分裂、增殖和转移具有抑制作用，同时还可阻断细胞因子的合成分泌，阻止肿瘤的形成[4]。P53基因失调或突变可诱导肿瘤细胞发生恶性增生、加速癌变进展。有研究证实肿瘤组织中P53基因突变或失调高达50%，在胃黏膜病变中可反映上皮细胞增生的程度[3,5]。生存素(Survivin)是至今发现的最具有代表性的凋亡抑制基因，在细胞异常增生过程中表达明显上调，可作为肿瘤标志物预测癌变程度[5]。胃窦黏膜蛋白-18(AMP-18或称为Gastrokine-1)是一种胃黏膜保护蛋白，在维持胃黏膜细胞有丝分裂等正常生理功能中具有重要意义，然而在癌变组织中表达下调[6]。Syk、P53、Survivin及AMP-18等物质在肿瘤疾病中均有突变或表达异常，但与胃癌的进展分期或癌变程度是否有一定相关性未见报道。本研究旨在分析大鼠胃黏膜组织中Syk、P53、Survivin及AMP-18 mRNA的表达和胃癌病变程度的相关性，以帮助胃癌早期诊断及治疗预防。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠48只，体重180～200 g，鼠龄约4个月，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(动物生产许可证号为SCXK(湘)2011-0003)。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、吐温20、维生素D3均购自上海麦恪林生化科技有限公司。RT-PCR 两步法试剂盒(TaKaRa生物工程有限公司)。GAPDH、Syk和Survivin等兔抗大鼠一抗购自美国Abcom公司；细胞核及细胞质蛋白试剂盒购买于武汉碧云天有限公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；Trizol试剂、氯仿、无水酒精、异丙醇均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 动物分组及造模

将48只SD大鼠(180～200 g)分为A、B、C、D 4组。A组给予生理盐水作为对照组，并于第24周处死取材。B组、C组和D组参照文献方法采用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导建立大鼠胃癌模型[6-7]，具体步骤如下：1～8周给予大鼠自由饮水，水中的MNNG溶液浓度为100 μg/ml的(内含4 mg/l吐温20和20 mg/l的维生素D3)；9～16周MNNG溶液浓度增加至150 μg/ml，17～24周MNNG溶液浓度为180 μg/ml，分别于第8周(B组)、第16周(C组)及第24周(D组)处死大鼠取材。

1.3 指标检测

1.3.1 胃黏膜组织病理切片评估 用过量水合氯醛(1 g/kg)深度麻醉处死大鼠，解剖取胃黏膜组织。每组取4只大鼠胃组织，经4%多聚甲醛固定后，行石蜡包埋常规切片(4 μm)。然后采用苏木精伊红染液行HE染色，光学显微镜下观察胃黏膜组织细胞病理学改变，比较各组大鼠胃黏膜病理损伤情况。

1.3.2 免疫印迹法检测大鼠胃黏膜Syk和Survivin蛋白表达 解剖腹部取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水清洗后，肉眼仔细观察胃黏膜变化，取一定量的胃黏膜组织，采用1%的苯甲磺酰氟(PMSF)裂解液(胃黏膜组织和裂解液以1∶10质量比匀浆)提取蛋白样品，10 000 rpb离心10 min(4 ℃)。吸取上清液测定总蛋白含量(BCA试剂盒)，计算后采用裂解液稀释样品将蛋白调至同一浓度。加入5×上样缓冲液沸水浴10 min使蛋白质变性，冷却后-80 ℃保存备用。取20 μl样品上样，通过10%SDS-P聚丙酰胺凝胶电泳跑胶分离蛋白，湿法转膜。分别加入β-actin(1∶3000)、Syk和Survivin蛋白(1∶500，美国Abcam)抗体4 ℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育后，ECL法曝光显影获得蛋白条带。

1.3.3 Q-PCR检测P53和AMP-18 mRNA水平 取各组胃黏膜组织35 mg，利用TRizol法提取总RNA，检测浓度并取10 μl的总RNA，根据cDNA Kit试剂盒进行逆转录。采用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR，Q-PCR)检测P53和AMP-18 mRNA的水平；反应体系总体积10 μl：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，正反向引物(10 μmol/l)各0.5 μl。扩增条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，扩增循环40次；最后一个循环95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃延伸15 s。每个样品设置3个重复，并以GAPDH作为内参测定P53和AMP-18 mRNA水平；定量PCR特异产物通过溶解曲线分析，以2-ΔΔCT表示相对基因表达变化。PCR引物序列见表1(北京鼎国昌盛生物技术公司)。

表1 引物序列

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠胃黏膜组织细胞病理改变

HE病理染色(均为400 ×)结果显示，A组大鼠胃黏膜完整正常，无炎性细胞浸润，且黏膜层、黏膜下层、肌层及外膜层等结构清晰可辨；B组大鼠胃黏膜组织和A组相似，黏膜腺体结构基本正常，未见炎性细胞；C组大鼠胃黏膜局部有破损，基底部部分腺体细胞形态异常，细胞核明显增大，有轻度异型性，提示胃癌早期；D组大鼠胃黏膜局部破损增加，黏膜下层及肌层有炎性细胞浸润，细胞形态不规则，部分腺体扩张，核质比增大，为胃癌进展期。

2.2 大鼠胃黏膜Syk和Survivin蛋白表达情况

本研究结果表明(如图1所示)，与A组比较，B组、C组和D组大鼠胃黏膜组织Syk蛋白水平明显下降(P<0.05)，且D组较B组进一步下降，差异有统计学意义(P<0.05)；而B组、C组和D组大鼠胃黏膜组织Survivin蛋白表达则逐渐递增(P<0.05)，且C组、D组与A、B组均有显著性差异(P<0.05)。

注：*为与A组比较，P<0.05；#为与B组比较，P<0.05。

2.3 大鼠胃黏膜组织P53和AMP-18 mRNA表达

B组、C组和D组大鼠胃黏膜组织P53表达逐渐增加，且C组、D组与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而B组、C组和D组大鼠胃黏膜组织AMP-18 mRNA水平逐渐下降(P<0.05)，C组、D组与A组有显著性差异(P<0.05)。D组P53和AMP-18 mRNA水平与B组均有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠胃黏膜组织P53和AMP-18 mRNA表达

3 讨论

既往病理学研究指出[8]，胃癌病变的进展特点为：癌组织浸润若位于黏膜下层以内，不论累及、病变范围多大或淋巴结有无转移均属早期胃癌；但癌组织浸润至肌层或更多则为进展期胃癌，表明胃癌病变加重。本文采用MNNG方法造模，HE病理染色观察到不同时期胃癌病变的进程，8周左右B组大鼠胃黏膜组织几乎和A组正常大鼠一样，基本无病变；16周C组大鼠胃黏膜基底部部分腺体细胞形态异常，细胞核增大，有轻度异型性，证实为胃癌早期；随着时间的延长，24周D组大鼠胃黏膜下层及肌层有炎性细胞浸润，细胞形态不规则，核质比明显增大，为胃癌进展期。本研究成功构建了不同时期的胃癌病变过程，有助于帮助探究大鼠胃黏膜组织Syk、Survivin、P53及AMP-18 mRNA表达和胃癌病变程度的相关性。

Syk、Survivin、P53基因等作为肿瘤细胞增生、凋亡等抑制基因，在机体免疫反应、癌变细胞的分裂、增殖和转移中发挥了重要作用[3-5,9]，而AMP-18在维持胃黏膜细胞正常生理功能中具有重要意义[6]，国外学者报道其在癌变组织中表达是降低的[10]。胃癌的病变发展是多阶段的，了解胃黏膜正常细胞发展到癌细胞过程中Syk、Survivin、P53及AMP-18表达是如何变化的对深入研究不同阶段的病因机制具有重要指导意义。目前，Syk、Survivin、P53及AMP-18等物质在胃癌病变程度中的表达情况，及其与胃癌的进展分期或癌变的关系程度未见报道。本研究Western blot结果显示，B组、C组和D组大鼠胃黏膜组织Syk蛋白水平明显下降(P<0.05)，而Survivin蛋白表达则逐渐递增(P<0.05)；此外，D组大鼠在胃癌进展期Syk和Survivin蛋白表达与B组比较有显著性差异(P<0.05)。这表明随着胃癌的进展，抑癌Syk蛋白减少，肿瘤细胞恶性增生、癌变加速；同时预测肿瘤的标志物Survivin蛋白表达上调，进一步证实细胞异常增生。Q-PCR提示C组和D组大鼠胃黏膜组织P53 mRNA表达逐渐上调(P<0.05)，而AMP-18 mRNA水平则逐渐下调(P<0.05)，且D组大鼠进入胃癌进展后，胃黏膜组织P53和AMP-18 mRNA水平与B组有统计学差异(P<0.05)。这一结果证实，胃癌病变进展过程中，P53基因失调增加了细胞增生，而AMP-18 mRNA水平在胃癌早期逐渐下降，胃癌进展期下降更显著提示胃黏膜遭到破坏。

综上所述，本研究比较了不同时期的胃癌病变中Syk、Survivin、P53及AMP-18等物质的表达，发现Syk 蛋白、AMP-18 mRNA表达随着胃癌病变程度的进展明显下降，而Survivin蛋白、P53mRNA表达则显著上升，表达量与 癌细胞浸润层次及病变程度有关。