基因芯片技术筛选HBV感染对肝癌细胞耐药突变的影响分析

张 毅 雷彩红 鲁峰刚

肝癌是临床常见恶性肿瘤，称之为癌症之王，有着较高发病率及死亡率，其中死亡率位于肿瘤死亡率的第3位。近几年来，肝癌的高发年龄已提前到35～50岁，呈现年轻化[1-2]。迄今为止，肝癌的发病机制及病因还不清楚，进而给治疗及预防带来了困难。因此，如何解决肝癌的早期诊断及早期治疗是肝胆外科医师的重要任务。化疗是治疗晚期肝癌重要方法，但是多药耐药限制了其疗效。近年来发现HBV在肝癌多药耐药发生及发展中有一定作用。本文为了进一步分析HBV感染对肝癌细胞耐药突变的影响，特采用基因芯片技术，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

由中国典型培养物保藏中心提供人肝癌细胞株HepG2细胞，由某医院提供HepG2.2.15细胞。基因芯片为Affymetrix的 Gene Chip primeview human。由Gene Chip HybridizationWash and Stain Kit提供洗涤和染色时机盒。由Life Technologies 公司提供 Agilent RNA 6000 Nano试剂盒；由Life Technologies公司提供PCR 试剂 Power SYBRGreen PCR Master Mix。由Invitrogen公司提供PCR引物。

1.2 方法

采用浓度为100 g/l胎牛血清的DMEM制作肝癌细胞株HepG2与HepG2.2.15，将其置于37 ℃下，体积分数为5%的二氧化碳培养箱内进行培养，生长在60%～80%时融合待于实验使用。采用Trizol 法进行样品的总RNA抽提，抽提之后的总RNA送到生物公司使用并进行质检，合格样本进入到基因芯片及Real time-PCR实验。质检合格之后的RNA样品采用基因芯片技术进行分析，筛选差异基因的标准设置：P<0.05，通过Gene Ontology功能软件进一步分析差异表达情况，选择表达强的前10位。

2 结果

2.1 基因引物序列及扩增片段长度分析

基因引物序列及扩增片段长度见表1所示。

表1 基因引物序列及扩增片段长度分析

2.2 总RNA质控

根据所提取的HepG2细胞及HepG2.2.15细胞总RNA，所提取的高纯度RNA如下表2所示。

表2 RNA 样本质检结果

2.3 药物相关差异表达基因生物过程

通过Gene Ontolgy功能分析表达基因的生物过程，从中发现与药物相关基因55个，上调基因数30个，下调基因数25个。包括与细胞周期调控、细胞增殖、药物代谢等相关基因，表达强的前10见表3、表4。

表3 上调基因功能富集分析

表4 下调基因功能富集分析

2.4 基因芯片中表达差异的基因

根据以往研究结果及此次差异表达基因，选择其中4个基因进行验证，见表5，表明基因变化与基因芯片相一致，基因芯片结果具有可靠性。

表5 差异表达基因的PCR验证结果

3 讨论

肝癌多发生于40～50岁，且男性发生率高于女性。迄今为止，原发性肝癌的发病机制尚不明确，在临床中多表现为肝区疼痛、肝大、全身及消化道症状，严重影响患者生活质量及身体健康[3]。长期以来，临床学者对肝癌的研究集中于1个或者几个基因上，并表明免疫组化、Soutern等杂交技术无法满足当前高通量杂交要求。高通量基因表达谱芯技术被认为是当前肿瘤发生、发展及转移基因表达的有效工具。基因芯片技术是1种新型技术，被广泛用于基因表达谱分析、多靶位同步超高通量药物筛选上。以往研究表明：肝癌多药耐药涉及有多基因、多阶段参与，且已证实HBV参与到多耐药基因的调控中，但机制并未明确[4]。本次研究中，将基因芯片表达技术用于研究HBV感染对肝癌细胞耐药突变的影响中，发现基因功能与基因间存在相互关系。利用基因芯片技术得到相关基因达到60多个，且涉及到的细胞种类有细胞周期调控基因、药物转运相关基因、药物代谢相关基因、细胞增值相关基因等。

此次研究中，药物相关基因55个，上调基因数30个，下调基因数25个。上调与下调基因多涉及细胞代谢、分化、编码细胞骨架结构、编码、转录、分解、凋亡等过程相关[5]。本研究结果表明，药物相关基因上调最为明显基因是CDH1、SEMA3C和FOS 等。CDH1是E钙黏蛋白的编码基因，其出现过甲基化会导致功能异常，引发肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药等。SEMA3C在肝癌等多种肿瘤组织中高表达，能够促进肿瘤细胞生长和转移。体外细胞研究发现，SEMA3C通过ERK1/2信号通路影响细胞的增殖、转移[6]。原癌基因c-FOS 能够通过和c-JUN、ATF/CREB等形成异源二聚体，特异性的识别DNA序列，促进细胞生长，在肿瘤中起重要作用。近年来，原癌基因c-FOS在肿瘤耐药中的作用备受关注，为多药耐药相关的分子机制提供了新的希望。

本研究显示，与药物下调相关的的基因有ABCG2、ARG1 和CYP1A1等。ABCG2在多种实体瘤中均有表达，且与多药耐药有关，但作用机制还不清楚[7-8]。ARG1是新的肝癌免疫标志物，有研究表明[9]，转染ARG1的293T细胞能够诱导MrP和GST耐药基因表达，可能成为肿瘤耐药新靶点。CYP1A1是CYP450酶系中的重要成员之一，能够间接参与肿瘤的发生，在肝脏可被高度诱导[10]。M1和M2多态性是目前对CYPIAI基因的研究与肿瘤易感性相关的主要基因[11]。研究表明[12]：CYPIAI基因MSP或者lie-val变异在吸烟人群中増加了患肝癌的风险，但是在非吸烟人群中不增加，这说明CYPIAI基因多态性在PAHs引起肝癌的过程中起着重要的作用。本次研究中发现CYPIAI基因下调，可能是由于在癌变发展过程中基因转录活性的改变，而在肿瘤不同部位中基因的改变有其特异性。既往研究表明，肝癌多药耐药与ABCB1、MrP2、LrP 和GST-pi 异常表达相关[13]。本实验采用Realtime-PCR检测了上述基因在Hep G2.2.15及Hep G2中的表达，再次验证HBV参与了肝癌多药耐药的调节，同时也表明基因芯片结果可信[14]。

综上所述，基因芯片技术正广泛地应用于肝癌的发生发展过程的研究，通过基因表达谱的分析来认识肝癌的发病机制，对原发性肝癌有了更为理性的认识。肝癌是个多基因、多环节、多途径参与的过程，可能涉及影响不同生化途径多群遗传因子表达的改变。