BET蛋白抑制剂JQ1增强索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制研究

王 宇，范璐璐

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤，据最新统计[1]，全世界新发肝癌患者每年约 70 万，居恶性肿瘤的第 5 位，肝癌因此被称为“肿瘤之王”。索拉非尼是治疗晚期肝癌的重要一线靶向药物，但其治疗效果尚不满意[2]，因此努力寻找有效的药物和最优化的治疗方法是当前的研究重点。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)属于溴化结构和BET家族蛋白，BRD4通过结合组蛋白诱导细胞的靶基因活化或抑制, 还可以结合乙酰化的非组蛋白, 来调控DNA复制、细胞周期及基因转录等其他细胞活动。因此，BRD4在肿瘤发生、发展中起着重要作用[3]。JQ1是一种小分子化合物, 是BET家族蛋白抑制剂, 可以竞争性结合于BRD4溴化结构, 阻止BRD4与乙酰化的赖氨酸结合[4]。该研究通过观察JQ1联合索拉非尼对肝癌细胞株的增殖抑制作用，并探讨其可能的机制，为肝癌的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料人肝癌细胞株HepG2、Bel-7402购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清购自美国Gibco公司；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；索拉非尼购自美国Selleck公司；JQ1购自美国MedChemExpress公司；兔来源抗人Bcl-2单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔来源抗人c-MYC单克隆抗体购自沈阳万类生物科技有限公司；兔来源抗人BIM单克隆抗体购自美国CST公司；鼠来源抗人Actin抗体和所有二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；化学发光显影试剂盒购自美国ThermoFisher公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；胰蛋白酶和DMSO均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养所有细胞在含有10%胎牛血清，1%青霉素和1%链霉素的DMEM高糖培养基中培养，在含有5%CO2的培养箱中于37 ℃培养，1～2 d换液一次，在细胞对数生长期时进行传代。

1.3 细胞增殖实验MTT方法检测细胞增殖抑制率。首先，将HepG2和Bel-7402以5 000个细胞/孔接种于96孔培养板中培养。用JQ1(1 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1联合索拉非尼分别处理细胞，同时设置空白对照组和阴性对照组，每组设置5个复孔，24、48 h之后向每个孔中加入10 μl MTT试剂，在37 ℃下孵育4 h。 然后，去除细胞培养上清液，并向每个孔中加入150 μl DMSO。 在37 ℃条件下孵育15 min。 最后，通过酶标仪在490 nm处确定每个孔的吸光度值。根据测量的吸光度值计算每个孔的增殖抑制率。

1.4 细胞凋亡实验Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。取对数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中。贴壁后加入DMSO、JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1联合索拉非尼分别处理细胞，24、48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，获取上清后使用预冷的PBS洗涤后离心，将离心后的细胞重悬于结合缓冲液中, 加入5 μl Annexin V-FITC室温避光孵育15 min，之后加入5 μl PI混匀。室温避光孵育5 min。使用FACS流式细胞仪测定凋亡细胞。早期和晚期凋亡细胞均包括在细胞死亡测定中。

1.5 蛋白提取与Western blot实验取对数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中。贴壁后加入JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1联合索拉非尼分别处理细胞,同时设置对照组，24 h后加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液置于冰上裂解30 min，将裂解物在低温(4 ℃)和高速(15 000 r/min)下离心15 min。通过BCA试剂盒检测上清液的蛋白质含量。在纯化的蛋白质样品中加入蛋白上样缓冲液，并在95 ℃条件下加热10 min。通过SDS-PAGE分离蛋白质样品，并在恒定电流下转移到PVDF膜上。使用5 %脱脂牛奶封闭含有蛋白质的膜，在4 ℃下与特异性一抗孵育过夜，然后加入相应的二抗(1 ∶50 000)在37 ℃孵育2 h。使用化学发光显影液使蛋白质条带可视化，上机扫描捕获信号并保存。

2 结果

2.1 JQ1联合索拉非尼对HepG2和Bel-7402肝癌细胞的增殖抑制作用使用MTT测定法分别检测对照组、JQ1(1 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1联合索拉非尼作用于HepG2和Bel-7402肝癌细胞24 h或48 h后，肝癌细胞的增殖抑制率(图1)。结果显示，在HepG2肝癌细胞中，24 h各组的增殖抑制率分别是(14.31±0.79)%、(23.94±1.23)%、(32.36±1.72)%和(61.78±1.48)%；48 h各组的增殖抑制率分别是(8.47±1.73)%、(46.32±6.45)%、(54.40±1.30)%和(65.86±2.76)%。在Bel-7402肝癌细胞中，24 h各组的增殖抑制率分别是(7.43±1.65)%、(34.82±3.23)%、(44.87±7.34)%和(58.50±0.40)%；48 h各组的增殖抑制率分别是(8.77±1.90)%、(33.87±036)%、(42.61±9.50)%和(56.75±0.55)%。单独应用索拉非尼或 JQ1以及JQ1联合索拉非尼组均可在体外抑制肝癌细胞的增殖，与单药组比较，联合用药组的增殖抑制率提高，差异有统计学意义(FHepG2,24 h=243.177，FHepG2,48 h=30.012，FBel-7402,24 h=7.62，FBel-7402,48 h=12.437，均P<0.05)。

图1 JQ1联合索拉非尼对肝癌细胞增殖率的影响

2.2 JQ1联合索拉非尼对HepG2和Bel-7402肝癌细胞的凋亡作用使用Annexin V-FITC / PI流式细胞术测定对照组、JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1联合索拉非尼作用于HepG2和Bel-7402肝癌细胞24 h或48 h后的细胞凋亡率(图2)。结果显示，在HepG2肝癌细胞中，24 h各组凋亡率分别是(6.53±1.60)%、(9.03±1.44)%、(18.97±2.74)%和(34.00±4.14)%；48 h各组凋亡率分别是(4.57±0.85)%、(12.20±1.78)%、(27.96±7.59)%和(59.73±2.12)%。在Bel-7402肝癌细胞中，24 h各组凋亡率分别是(7.23±1.53)%、(10.83±1.70)%、(16.20±1.75)%和(26.30±1.43)%；48 h各组凋亡率分别是(7.87±0.63)%、(9.57±0.39)%、(16.60±4.65)%和(48.83±3.77)%。结果显示JQ1联合索拉非尼处理后，HepG2和Bel-7402肝癌细胞凋亡增加，差异有统计学意义(FHepG2,24 h=11.016，FHepG2,48 h=18.125，FBel-7402,24 h=8.174，FBel-7402,48 h=51.243，均P<0.05)。

图2 JQ1联合索拉非尼对肝癌细胞凋亡的影响

2.3 JQ1联合索拉非尼对c-MYC、Bcl-2、BIM表达的影响通过Western blot检测JQ1联合索拉非尼对HepG2和Bel-7402细胞中c-MYC和凋亡蛋白Bcl-2，BIM的表达的影响，在索拉非尼和JQ1单独用药组，Bcl-2和c-MYC表达降低，BIM表达增加，以联合用药组最为明显(图3)。

图3 JQ1联合索拉非尼对c-MYC、Bcl-2、BIM表达的影响

3 讨论

索拉非尼是一种口服多激酶抑制剂，是治疗晚期肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要靶向药物。但其疗效尚不满意[5]，因此，发现新的干预手段以期提高肝癌细胞对靶向药物的敏感性，是一种治疗肿瘤的新策略。

研究[9]表明在Bcl-2家族的多种成员中，Bcl-2是最主要的凋亡抑制基因，BIM是Bcl-2家族蛋白中最重要的成员，在Bcl-2家族蛋白的4个结构域(BH1～BH4)中，BIM与BH3具有相同的结构域，在本质上具有高度促凋亡作用。BIM在生理和病理生理条件下都启动了内在的凋亡通路。BIM表达的减少与肿瘤的促进和自身免疫有关，而过表达则抑制肿瘤生长和耐药性，因为癌细胞会抑制BIM的表达和稳定性[10]。c-MYC基因通过易位、扩增和突变参与许多肿瘤癌变过程，如神经母细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌等[11]。本研究Western blot结果显示，各给药组均可促进了BIM的表达，抑制Bcl-2的表达，致使HCC细胞的凋亡。以联合用药组最为显著，JQ1和索拉非尼联合应用可能存在协同作用。

综上所述，一定浓度JQ1能增强索拉非尼对肝癌细胞的增殖抑制及凋亡作用，其机制可能在于通过下调Bcl-2和c-MYC的表达，上调BIM表达，JQ1和索拉非尼联合应用可能存在协同作用，为肝癌的治疗提供新思路。但是本研究只是在细胞水平的初步探讨, 还需要大量的动物和临床试验进一步证明。