体外转录小鼠MAGE-A3 mRNA在NIH/3T3细胞中的表达

陈鹤丹，林 煊，谢 颖，陈 尧，杨君仪,王 赟,3,张世超，胡祖权，曾 柱,3,4，刘丽娜,4

信使RNA(messenger RNA, mRNA)疫苗是近年来受到广泛关注的有潜力的抗肿瘤免疫治疗策略，现代分子生物学技术的发展增强了体外转录mRNA的稳定性和翻译效率的提高[1]，此外，mRNA疫苗还具有合成简便、价格较低、安全性好、能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答等优点[2-3]。黑色素瘤抗原A3(melanoma antigen family A3, MAGE-A3) 是一种肿瘤-睾丸抗原(cancer-testis antigens, CTA)，在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤组织中表达，在肿瘤患者中，MAGE-A3能同时诱导体液和细胞免疫应答[4]。多个以MAGE-A3为基础的疫苗进入临床试验，但试验结果提示需要在疫苗设计、佐剂选择等方面开展研究[4]。因此，该研究通过构建编码MAGE-A3 基因的真核表达载体，体外转录获得含5′抗反向帽类似物(anti-reverse cap analog, ARCA)帽、3′Poly(A)尾的修饰的MAGE-A3 mRNA，并实现MAGE-A3 mRNA在哺乳动物细胞NIH/3T3中的翻译和表达，为MAGE-A3 mRNA疫苗的体内免疫实验奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂pcDNA3. 1(+)质粒、感受态细胞(DH5α)为实验室保存；NIH/3T3细胞、4T1细胞购自中国科学院上海细胞库; Anti-β-tubulin抗体购自英国Abcam 公司; HRP标记的山羊抗兔 IgG抗体、Anti-MAGE-A抗体购自美国 Santa Cruz 公司; Opti-MEM无血清培养基购自美国 Gbico 公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司; TRIzol试剂、逆转录试剂盒购自美国 Invitrogen 公司；质粒DNA小量纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、琼脂糖、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR I、XhoI限制性内切酶购自日本TaKaRa 公司；MEGAscriptTMT7试剂盒、 MEGAclearTM试剂盒、poly(A)尾试剂盒购自美国Ambion 公司; TransIT®-mRNA试剂盒购自美国 Mirus 公司; ARCA帽购自美国NEB公司; 修饰核苷酸购自美国TriLink Bio Tech公司; 引物合成和质粒DNA测序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1三阴型乳腺癌4T1细胞总RNA提取 将三阴型乳腺癌4T1细胞培养至细胞生长汇合度达 80%～90%时，采用TRIzol试剂法提取4T1细胞总RNA，最后用15 μl DEPC水溶解RNA沉淀。

1.2.2MAGE-A3基因的扩增及回收 以含MAGE-A3基因全长的4T1 cDNA为模板，进行PCR扩增，反应条件为95 ℃ 预变性5 min，95 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min 20 s，30 个循环后72 ℃ 延伸10 min终止。PCR扩增产物切胶回收后得到MAGE-A3目的片段。MAGE-A3基因上游引物：5′-GTGGAATTCGCCACCATGGCTGATTCCC AT-3′(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)；下游引物：5′-ATACTCGAGCTAGAATGTGTGTAGGT-3′(下划线部分为XhoⅠ酶切位点)。

1.2.3重组质粒pcDNA3.1-MAGE-A3的构建及鉴定 分别对PCR回收产物和pcDNA3.1(+)质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切。双酶切后用切胶回收试剂盒回收酶切片段，将回收片段用T4 DNA连接酶于16 ℃连接过夜。次日将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，培养过夜后挑选阳性单克隆菌落进行扩大培养。按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。对重组质粒进行单/双酶切1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，对其进行测序确认重组质粒成功构建。

1.2.4体外转录修饰的MAGE-A3 RNA、加尾及纯化 以上述pcDNA 3.1(+)/MAGE-A3重组质粒作为体外转录模板，使用修饰核苷酸代替MEGAscriptTMT7试剂盒内的胞苷和尿苷，添加ARCA，按体外转录试剂盒说明书进行体外转录合成RNA后添加Poly(A)尾，最后按照清除试剂盒说明书对产物进行纯化。

1.2.5纯化的MAGE-A3 mRNA转染NIH/3T3细胞 将NIH/3T3细胞铺于六孔板中，培养至细胞密度达到80%后，用TransIT®-mRNA试剂盒转染NIH/3T3细胞，具体步骤参考试剂盒说明书。

1.2.6Western blot检测MAGE-A3蛋白的表达 收集目的细胞，分别取20 μg细胞总蛋白样品，恒压140 V进行蛋白电泳2 h，在低温恒流250 mA的条件下，转膜1 h。50 g/L 脱脂奶粉室温封闭1 h，洗膜。Anti-MAGE-A抗体和Anti-β-tubulin抗体一抗(1 ∶1 000)4 ℃ 过夜后，室温孵育HRP标记的山羊抗兔 IgG二抗(1 ∶5 000)1 h。使用凝胶成像系统对PVDF膜进行曝光。

2 结果

2.1 三阴型乳腺癌4T1细胞提取总RNA琼脂糖凝胶电泳通过TRIzol试剂从4T1乳腺癌细胞中提取得到总RNA样品，取2 μl RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。图1可见提取的总RNA条带分别为28、18、5 s(s为沉降系数)，说明提取的总RNA符合后续要求。

图1 三阴型乳腺癌4T1细胞提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳M: DL 2 000 DNA Marker; 1: 4T1细胞总RNA

2.2 RT-PCR扩增MAGE-A3基因PCR扩增结束后，取9 μl PCR样品，加入1 μl 10×Loading Buffer，混匀后，进行琼脂糖凝胶电泳。由图2可看出PCR扩增的特异性条带在1 000 bp左右，与预期相符，表明成功扩增MAGE-A3基因。

图2 PCR扩增MAGE-A3琼脂糖凝胶电泳M: DL 8000 DNA Marker; 1、2: MAGE-A3 PCR产物

2.3 重组质粒的酶切鉴定和测序分析挑单克隆扩大培养后，提取质粒后进行酶切鉴定，待酶切过夜后，取出。然后加入1 μl 10×Loading Buffer，混匀之后，进行电泳。由图3可见，只有2号质粒双酶切后出现一条1 000 bp左右的目的基因条带和一条 4 000～5 000 bp的载体条带，证实重组质粒构建成功。

2.4 体外转录mRNA的检测经Thermo Nano DropTM2000测定的体外转录mRNA A260/A280比值为1.92，mRNA浓度为872.3 ng/μl。 最后将转录模板DNA与转录产物mRNA进行琼脂糖凝胶电泳，从图4可看出，转录模板条带在1 000 bp左右，mRNA转录产物条带在500 bp左右，因为模板DNA为双链结构，而转录得到的mRNA为单链，转录得到的mRNA理论上应该为双链DNA的一半。

图3 重组质粒单/双酶切后的琼脂糖凝胶电泳M: DL 8000 DNA Marker；1、2、3: 重组质粒的单/双酶切产物

图4 体外转录mRNA的琼脂糖凝胶电泳M: DL 2000 DNA Marker；1: 转录模板DNA；2: 体外转录mRNA

2.5 体外转录MAGE- A3 mRNA在NIH/3T3细胞中的表达将体外转录MAGE-A3 mRNA 转染到NIH/3T3 细胞后培养 48 h，提取对照组NIH/3T3细胞及转染MAGE-A3 mRNA的NIH/3T3 细胞总蛋白。图5结果表明MAGE-A3 mRNA成功转染到NIH/3T3细胞中，对照组与转染组之间MAGE-A3的表达存在差异，差异有统计学意义(P<0.01)。

图5 Western blot法检测 MAGE-A3蛋白的表达A: 对照组; B: 转染MAGE-A3 mRNA组；与对照组比较：**P<0.01

3 讨论

mRNA在革新疫苗、替代蛋白疗法和遗传性疾病的治疗等方面表现出巨大潜力[5]。在肿瘤治疗研究方面，有将mRNA直接注射到淋巴结内，在淋巴结内启动幼稚T细胞，能有效诱导T细胞免疫应答[6]；也有将mRNA瘤内注射，直接作用于经树突状细胞活化、迁移并浸润肿瘤的肿瘤浸润T细胞，以及利用mRNA编码的免疫调节因子在肿瘤内的表达，去改善抑制性的肿瘤微环境[7-8]；此外，瘤内注射编码肿瘤抗原的mRNA可以直接活化已经负载死亡肿瘤细胞释放的肿瘤抗原、驻留肿瘤的树突状细胞[9]。自2008年起，大量的mRNA肿瘤疫苗进入临床试验[6]。因此，本研究构建编码肿瘤特异性抗原MAGE-A3的体外转录mRNA，在哺乳动物细胞中证实体外转录MAGE-A3 mRNA能正常翻译表达，为后续动物实验研究MAGE-A3 mRNA疫苗的抗肿瘤效果奠定了基础。

mRNA应用于治疗，它的可翻译性、稳定性以及免疫刺激活性是关键因素，通常针对这几点进行优化改进[10]。mRNA 5′端帽子会影响翻译起始因子eIF4E的识别，对帽子结构进行修饰，可抑制RNA去帽和增强mRNA抵抗酶降解的能力，进而提高mRNA的翻译效率[11]。目前帽类似物中使用ARCA用于合成体外转录mRNA，可提高mRNA的翻译效率[12]。RNA碱基的化学修饰可增强mRNA的免疫刺激活性，在mRNA疫苗设计中很重要[13]。Poly(A)尾，将其长度增加至约120个A，可提高mRNA的稳定性和蛋白质表达量[6]。最适翻译的体外转录mRNA的合成，通常以线性DNA为模板，使用T7噬菌体RNA聚合酶进行体外合成[14]，合成得到的mRNA分子包含5′帽子结构、目的基因的完整开放阅读框、3′Poly(A)尾[13]。本研究体外转录合成的就是含5′ARCA帽、3′Poly(A)尾的修饰的MAGE-A3 mRNA。

Kozak序列是一段位于真核生物基因翻译起始密码子周围的核酸序列，在翻译起始中发挥重要的识别作用。脊椎动物mRNA的Kozak序列多数为GCC R CC AUG G(此处R为A/G)。起始密码子AUG的A为+1，其上游的C为-1。已证实-3位为嘌呤碱基A时，+4位为G对上调蛋白表达起关键作用[15]。因此，在MAGE-A3 mRNA 5′端设计了GCCACCAUGG序列以增强MAGE-A3 mRNA翻译效率。

本研究设计的体外转录MAGE-A3 mRNA能在哺乳动物细胞中成功表达肿瘤特异性抗原MAGE-A3蛋白，为后续研究该mRNA疫苗的免疫效果奠定了基础。