索拉非尼对人RKO结肠癌细胞增殖、周期及凋亡的影响

刘蒙蒙，倪谦枝，李晶晶，谢 东，陈天伟，高振军，黄继英，庄一心

结肠癌是全球第三大常见肿瘤，随着居民生活水平的提高及饮食习惯的改变，其国内发病率排在恶性肿瘤和致死因素的第四位，且正逐步攀升[1]。目前治疗结肠癌的手段主要为手术切除、放化疗、中医治疗和靶向治疗。手术和放化疗对进展期的结肠癌治疗效果不理想，而靶向治疗逐渐成为治疗结肠癌的热点[2]。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，其主要通过受体酪氨酸激酶抑制肿瘤生长和血管生成，是晚期肝细胞癌患者为数不多的全身治疗方案[3-4]。研究[5]表明索拉非尼可通过PI3K/AKT/mTOR信号通，抑制肝癌细胞的增殖。该研究探究索拉非尼对人结肠癌RKO细胞的增殖抑制作用及其可能作用机制，为将来临床采用索拉非尼治疗结肠癌提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料人结肠癌RKO细胞购自中国科学院细胞库，DMEM及胎牛血清FBS购自美国Thermo Fisher公司，凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen公司，caspase-3、caspase-8、PARP和GADPH一抗抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，索拉非尼片购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1MTT增殖检测 将人肠癌RKO细胞稳定培养后消化、传代，96孔板中每孔中加入1×104个/ml人肠癌RKO细胞悬浊液200 μl。贴壁后，更换完全培养基，添加不同浓度(0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)索拉非尼，对照组为二甲基亚砜处理。培养48 h 后，MTT法测定490 nm吸光度值。取索拉非尼的半数抑制浓度(the half inhibition of concentration，IC50)组为实验组。

1.2.2细胞克隆形成 针对上述对照组及实验组处理细胞，于6孔板中每孔中加入1 500个人肠癌RKO细胞，培养10 d后，弃去上清液，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色15 min。

1.2.3流式检测细胞凋亡及细胞周期 针对实验组及对照组，用胰蛋白酶法收获细胞。在FITC-Annexin V和碘化丙啶双重染色后，使用FITC-Annexin V凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪进行细胞凋亡检测。使用cycle TEST PLUS DNA试剂盒对细胞进行碘化丙啶染色后，通过流式细胞仪进行细胞周期检测，并通过FACScan软件进行分析。

1.2.4Western blot检测凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和PARP表达 使用含有蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液裂解细胞，BCA蛋白分析试剂盒对提取的总蛋白浓度进行定量，10% SDS-PAGE凝胶分离等量的总蛋白，然后转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h后，将膜与对应的一抗抗体(caspase-3、caspase-8和PARP)在4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶结合山羊抗兔二抗在室温下以1 ∶5 000的稀释度作用1 h，并且使用Pierce ECL Western印迹底物检测蛋白质信号。

2 结果

2.1 不同浓度索拉非尼对结肠癌RKO细胞增殖的影响MTT检测RKO细胞增殖，结果显示索拉非尼对RKO细胞具有抑制作用，并呈浓度依赖的关系(图1A)。索拉非尼对RKO细胞株作用的IC50为10.0 μmol/L。克隆形成实验结果显示，索拉非尼(10.0 μmol/L)对细胞增殖具有抑制作用(P<0.001，图1B)。

图1 不同浓度索拉非尼对结肠癌RKO细胞增殖的影响

2.2 索拉非尼对结肠癌细胞RKO凋亡的影响通过Annexin V-FITC/PI 法测定两组凋亡率，结果显示实验组细胞凋亡率为(32.53±6.64)%，对照组凋亡率为(4.47±2.09)%，两组比较差异有统计学意义(P<0.01，图2)。

图2 索拉非尼对结肠癌细胞RKO凋亡的影响

2.3 索拉非尼对结肠癌细胞RKO周期的影响PI法检测两组细胞周期，结果显示实验组RKO细胞处于G1期的比例为(56.92±2.25)%，G2期比例为(14.94±5.01)%，S期比例为(28.14±3.04)%；对照组处于G1期细胞的比例为(24.53±1.70)%，G2期比例为(31.70±2.88)%，S期比例为(43.77±1.19)%；RKO的三个细胞时期比例均有变化(P<0.01，图3)。

图3 索拉非尼对结肠癌细胞RKO周期的影响

2.4 索拉非尼对结肠癌细胞RKO凋亡相关蛋白表达的影响Western blot结果显示，实验组凋亡关键蛋白酶caspase-3和caspase-8表达水平高于对照组，并且caspase-3激活指示蛋白PARP的表达水平同样高于对照组(P<0.05，图4)。

图4 索拉非尼对结肠癌细胞RKO凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨论

结肠癌是病死率最高的三大消化系统肿瘤之一，确诊病例中约50%～60%的肿瘤发生转移，预后很差[6-7]。化疗被认为是结肠癌患者的标准治疗方法，但化疗的局限性不容忽视，如选择性低、在肿瘤组织中浓度不足、全身毒性等[8]。所以挖掘肿瘤有效治疗靶标具有重要的临床指导价值。

索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，是美国食品药品监督管理局于2007年批准的首个治疗肝癌的一线全身治疗药物。索拉非尼具有多种作用部位，抑制VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR-β、RAF家族激酶[9]。在具有里程碑意义的临床Ⅲ期试验中，针对602例肝癌患者，与安慰剂比较，索拉非尼提高了中位总生存期(10.7个月vs7.9个月，P<0.001)[10]。作为一种多功能抑制剂，索拉非尼具有抑制肿瘤生长、进展、转移、血管生成和下调机制的潜力，可保护肿瘤不受凋亡的影响。

Liu et al[11]证实索拉非尼通过ATP-AMPK-mTOR-SREBP1信号通路阻断SCD1介导的单不饱和脂肪酸的合成，从而杀死肝癌细胞。Gounder et al[12]针对87例进行性、症状性或复发性硬纤维瘤患者，接受索拉非尼(400 mg/片，每天一次)或安慰剂，在平均27.2个月的随访中，索拉非尼组2年无进展生存率为81%(95%CI为69%～96%)，安慰剂组为36%(95%CI为22%～57%)(进展或死亡危险比为0.13，95%CI为0.05～0.31，P<0.001)，研究表明在进行性、复发性或有症状的硬纤维瘤患者中，索拉非尼延长无进展生存期并诱导持久反应。Corrado et al[13]证实索拉非尼在体内外对甲状腺癌细胞具有抗增殖和抗血管生成作用。所以，本研究尝试探索索拉非尼对人RKO肠癌细胞的抑制作用及其可能机制。

本研究结果表明，索拉非尼对结肠癌RKO细胞有增殖抑制和促凋亡作用，而且随着索拉非尼浓度增加，对RKO细胞的抑制效果越明显。同时发现，索拉非尼主要是通过增加caspase-8、caspase-3以及PARP的表达来促进结肠癌细胞的凋亡。在肿瘤中，常见调节细胞周期机制和频率元件的错乱反映出异常的细胞周期对肿瘤恶性增殖表型的重要性[14]。长期以来，靶向细胞周期被视为一个潜在的治疗的靶点，但由于早期细胞周期抑制剂特异性较低，限制了这种靶向抑制的发展[15]。本研究发现索拉非尼对肠癌细胞RKO的细胞周期有影响，索拉非尼处理之后，G1期细胞增多，而S期和G2期细胞减少，说明索拉非尼可以将RKO细胞阻断在DNA合成前期，从而抑制细胞增殖。

综上所述，本研究发现索拉非尼对结肠癌RKO细胞增殖有抑制作用，而且和使用的浓度呈正相关。索拉非尼通过促进RKO细胞的凋亡来抑制结肠癌细胞的增殖。同时，本研究还发现索拉非尼会影响RKO细胞的细胞周期。这为将来用索拉非尼治疗结肠癌提供一定的参考价值。