CrkⅡ表达水平对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响

刘东东，周李芳，杨华晖

荆州市中医医院耳鼻咽喉头颈外科，湖北 荆州 448002

喉癌是临床常见的头颈部恶性肿瘤，其中，绝大多数为喉鳞状细胞癌，主要表现为呼吸困难、发音困难、声音嘶哑等临床症状，其具体发病机制目前尚未完全明确，可能与饮酒、吸烟、咽喉反流、胃食管反流、微量元素缺乏和放射线等因素有关，且通常多种因素相互作用[1-2]。根据发生位置的不同，喉癌可分为声门上型、声门型和声门下型，具有局部肿瘤浸润、区域淋巴结转移、远处扩散等特征。接头蛋白CrkⅡ为原癌基因Crk表达的产物，在蛋白质之间起介导作用，介导细胞之间的信号转导[3-4]。CrkⅡ与细胞骨架重构、侵袭、增殖、迁移及凋亡等均有一定关系[5]。本研究分析CrkⅡ表达对喉癌细胞Hep-2增殖、迁移及侵袭的影响，为喉癌患者的临床诊疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年12月至2018年12月荆州市中医医院收治的喉癌患者，所有患者均经病理检查确诊为喉鳞状细胞癌，年龄为38～74岁，平均（56.27±5.09）岁。本研究共纳入108例喉癌患者，收集其喉癌组织及癌旁正常组织（距离肿瘤边缘＞0.5 cm）的石蜡存档标本。喉鳞状细胞癌细胞Hep-2由本院头颈肿瘤课题组提供。

1.2 主要试剂与仪器

磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640均购自美国Hyclone公司，Opti-MEM购自美国Gibco公司，pGPU6/RFP/Neo载体购自上海吉玛制药技术有限公司。倒置荧光显微镜、水浴锅均购自德国Leica公司，超净工作台购自苏州金净净化设备科技有限公司，数显恒温水浴锅购自常州金南仪器制造有限公司，荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化染色方法及结果判定 采用免疫组化染色法检测喉癌组织中CrkⅡ蛋白的表达情况，CrkⅡ蛋白主要表达于细胞质，少许表达于细胞核，细胞质和细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞[6]。随机选取5个高倍视野，对阳性染色细胞数量和肿瘤细胞总数进行计算。依据阳性细胞所占百分比评分：≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。依据染色强度评分：无色计0分，浅棕色计1分，棕黄色计2分，深棕色计3分。染色强度评分和阳性细胞所占百分比评分相加，≤3分为阴性表达，＞3分为阳性表达。

1.3.2 CrkⅡRNA干扰质粒构建与验证 通过NCBI检索CrkⅡ基因序列，设计干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）序列，基因 ID 为1398，mRNA 序列号为 NM-016823。使用 Invitrogen公司在线设计软件设计靶向CrkⅡ基因的siRNA干扰序列，依据序列设计原则，经NCBI行BLAST同源对比后，筛选出最优siRNA序列，并设计一条无关序列作为阴性对照。针对CrkⅡ基因的shRNA序列插入至质粒载体内，包含目的基因的序列全部无误，表明CrkⅡRNA干扰质粒构建成功。

1.3.3 载体选择与构建 选取pGPU6/RFP/Neo表达载体，此载体内含有Neomycin抗性筛选标记基因和红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）表达基因，以便筛选稳定表达的单克隆细胞系并检测转染效率，于Bbsl和BamH1酶切位点插入设计好的siRNA序列，并委托上海吉玛制药技术有限公司完成CrkⅡRNA干扰质粒的构建和测序。

1.3.4 细胞培养 ①细胞复苏：取出冻存的Hep-2细胞，置入预热（39℃）水浴锅内，解冻后将细胞悬液吸出，置于离心管内，加入含10%胎牛血清的1640培养基10 ml，选取1支废弃离心管配平，离心后加入完全培养基，重悬细胞并充分吹打，预防细胞呈团块，将细胞悬液移至培养瓶内，补充完全培养基，置于培养箱内培养。②细胞传代：细胞融合至80%时，倒掉旧培养液，立刻加入2 ml无菌PBS，冲洗2次后将1 ml 0.25%胰蛋白酶加入培养瓶，翻转使细胞与胰蛋白酶充分接触，于培养箱内培养1 min，巴氏吸管吸取瓶内培养液，反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱落并形成单个细胞悬液，以1∶2或1∶3的比例接种于T25细胞培养瓶内，再置入培养箱内进行培养，第2天换液。③细胞冻存：将完全培养基（含20%胎牛血清）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）按照9∶1的比例制备冻存液，融合度为70%～80%时选取细胞，于倒掉原有培养基的培养瓶中加入2 ml PBS，冲洗2次，PBS洗掉后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，贴壁细胞完全消失后加入培养基，将细胞吹打为单细胞悬液，以2500 r/min的离心速度离心6 min后，去除原培养液和胰蛋白酶，加入至预先配置好的冻存培养液，使用巴氏吸管将细胞吹散为细胞悬液，采用1 ml冻存管分装。

1.3.5 细胞转染与分组 将细胞接种至6孔板内，补足2 ml无抗生素完全培养基，确保转染时融合度为60%～80%，于150 ml无血清培养基Opti-MEM内稀释4.0 mg NDA，摇匀；于150 ml无血清培养基Opti-MEM内稀释10 ml LipofectamineTM2000试剂，摇匀后孵育6 min，将稀释的LipofectamineTM2000试剂加入至质粒稀释液内，室温下孵育20 min，将上述转染复合物加入至各个培养孔内，并上下左右翻转使细胞与转染复合物充分接触，后放置培养箱内培养5 h，去除转染复合物，加入不含抗生素的完全培养基。将实验细胞分为空白对照组（无转染质粒）、阴性对照组（转染阴性对照质粒）和实验组（转染CrkⅡ干扰质粒）。将CrkⅡRNA质粒转染至Hep-2细胞内，转染24、48、72 h后，使用倒置荧光镜观察RFP的表达情况，细胞呈现红色荧光表明CrkⅡRNA干扰质粒能够对Hep-2细胞进行转染，且Hep-2细胞可稳定表达CrkⅡ。

1.3.6 实时荧光定量PCR检测CrkⅡmRNA表达情况 转染后提取细胞总RNA，合成cDNA第一条链，行实时PCR扩增，CrkⅡ的上游引物为5'-GATTGAGATGATTTTGGAG-3'，下游引物为5'-GTATGTTAAGTATATGATTG-3'，扩增片段长度是482 bp；内参β-actin的上游引物为5'-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3'，下游引物问5'-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3'，扩增片段长度是 482 bp。42℃预变性，60 min；70℃，15 min；PCR反应条件：94 ℃，45 s；55 ℃，50 s；72 ℃，75 s，共40次循环。

1.3.7 蛋白质印迹法（Western blot）检测CrkⅡ蛋白表达情况 转染后提取总蛋白，组织裂解后上样电泳，初始电压为80 V，溴酚蓝染料前缘进入至分离胶上缘后，提高电压至100 V，溴酚蓝泳出分离胶下缘后电泳结束。采用半干电转移仪将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜内，以30 mA恒流连续处理90 min。取出PVDF膜后，采用5%TBST脱脂奶粉封闭，振荡60min。结束封闭后采用TNS-T漂洗液洗膜3次，每次10 min，将膜转移至杂交袋内，加入适量漂洗液稀释抗体，封口后于4℃下孵育过夜；用TBST漂洗液洗膜3次，每次10 min，加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，振荡60 min。PVDF膜置于电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显色液内振荡温育5 min，暗室下曝光、显影和定影。清水冲洗后，晾干扫描，采用IPP软件对扫描图像的目的条带行灰度分析。

1.3.8 噻唑蓝法检测Hep-2细胞增殖情况 采集处于对数生长期的细胞，细胞悬液含量为1×104/ml，96孔板接种，倒入200 ml细胞悬液，放入培养箱中培养；然后，每孔内加入剂量为5 mg/ml的噻唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）溶液20 ml，于培养箱内继续培养4 h；倒掉原MTT培养液，加入DMSO溶解液150 ml，培养板置于摇床振荡8 min，充分溶解蓝紫色结晶甲瓒。于24、48、72 h分别取一块96板孔，测定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.3.9 Transwell实验检测细胞侵袭能力 于无血清培养液中“饥饿”处理细胞，将细胞重悬计数后稀释至1×105/ml，接种至Transwell小室中，添加0.5 ml细胞悬液，于24孔板下室加入0.75 ml含10%FBS的完全培养液，培养箱内培养24 h，培养孔内加入1 ml 4%甲醛溶液，固定10 min，PBS洗涤，然后，每孔加入1 ml 0.1%结晶紫溶液，染色30 min，PBS洗涤3次，晾干后置于显微镜下观察。

1.3.10 细胞划痕实验检测Hep-2细胞迁移能力采集细胞并计数，将重悬细胞浓缩至5×105/ml，6板孔内分别加入细胞悬液2 ml，细胞融合度为80%～90%时，采用加样枪头在6孔板底中划痕，PBS冲洗，去除脱落细胞，而后加入培养液，在培养箱中培养。利用软件测量并计算培养24、48 h后细胞的迁移率。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析和重复测量方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CrkⅡ蛋白表达情况的比较

免疫组化染色结果显示，喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率为68.52%（74/108），明显高于癌旁正常组织的9.26%（10/108），差异有统计学意义（χ2=4.157，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的表达情况

临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、组织分化程度为中低分化、有淋巴结转移喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率均高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、组织分化程度为高分化、无淋巴结转移的喉癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征的108例喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达情况

2.3 CrkⅡRNA 干扰质粒测序及转染情况

CrkⅡRNA干扰质粒测序结果显示，针对CrkⅡ基因的shRNA序列插入至质粒载体内，包含目的基因的序列全部准确无误，CrkⅡRNA干扰质粒构建成功。CrkⅡRNA转染至Hep-2细胞内72 h时，Hep-2细胞中可观察到稳定表达的RFP。

2.4 喉癌细胞Hep-2中CrkⅡmRNA的表达情况

实时荧光定量PCR检测结果显示，空白对照组、阴性对照组、实验组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡmRNA 的表达水平分别为（1.00±0.00）、（1.03±0.02）、（0.52±0.02），3组比较，差异有统计学意义（F=4.097，P＜0.01）。实验组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡmRNA的相对表达量低于阴性、空白对照组，差异均有统计学意义（t=3.498、4.117，P＜0.05）。

2.5 喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的表达情况

空白对照组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相对表达量为（0.84±0.03），阴性对照组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相对表达量为（0.83±0.04），实验组喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相对表达量为（0.46±0.03），3组比较，差异有统计学意义（F=4.014，P=0.003）。实验组Hep-2细胞中CrkⅡ蛋白的相对表达量低于阴性对照组、空白对照组，差异均有统计学意义（t=4.509、5.226，P＜0.05）。

2.6 CrkⅡ蛋白表达下调对Hep-2细胞增殖能力的影响

MTT检测结果显示，Hep-2细胞培养24、48、72 h时，3组细胞的OD值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验组Hep-2细胞不同时间点的OD值均低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同组别不同时间点转染后Hep-2细胞OD值的比较（±s）

表2 不同组别不同时间点转染后Hep-2细胞OD值的比较（±s）

注：*与实验组比较，P＜0.05

组别空白对照组阴性对照组实验组F值P值24 h 0.37±0.01*0.37±0.02*0.33±0.02 3.978 0.015 48 h 0.68±0.02*0.68±0.01*0.57±0.02 5.262 0.009 72 h 0.81±0.01*0.81±0.02*0.68±0.02 4.946 0.010

2.7 CrkⅡ蛋白表达下调对Hep-2细胞侵袭能力的影响

Transwell实验检测结果显示，CrkⅡ蛋白的表达下调后，实验组穿过基质膜至下室的细胞数目为（98±6），阴性对照组穿过基质膜至下室的细胞数目为（150±7），空白对照组穿过基质膜至下室的细胞数目为（154±6），3组比较，差异均有统计学意义（F=6.294，P＜0.05）。实验组穿过基质膜至下室的细胞数目低于阴性对照组和空白对照组，差异均有统计学意义（t=4.509、3.921，P＜0.05）。（图1）

图1 Transwell 检测不同组别Hep-2细胞的侵袭能力（SP法染色，×200）

2.8 CrkⅡ基因沉默对Hep-2细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验检测结果显示，转染24 h时，3组细胞的迁移率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。转染48 h时，3组细胞的迁移率比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。转染48 h时，实验组细胞的迁移率低于阴性对照组、空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3）

表3 不同组别不同时间点Hep-2细胞迁移率的比较（%，±s）

表3 不同组别不同时间点Hep-2细胞迁移率的比较（%，±s）

注：*与实验组比较，P＜0.05

组别空白对照组阴性对照组实验组F值P值24 h 0.21±0.03 0.20±0.04 0.19±0.04 0.418 0.374 48 h 0.61±0.06*0.59±0.07*0.24±0.05 8.153 0.001

3 讨论

本研究结果显示，CrkⅡ蛋白在喉癌组织中高表达，在癌旁正常组织内仅少量表达，说明CrkⅡ蛋白可能与喉鳞状细胞癌的发生与进展关系密切。本研究中，伴淋巴结转移、临床分期高和组织分化程度为中低分化的喉癌患者喉癌组织中CrkⅡ蛋白的阳性表达率较高，说明CrkⅡ蛋白可促进喉癌细胞的生长、侵袭和转移。基因沉默指的是生物体中特定基因的表达被抑制或不表达的状况，发生于两个水平：①转录后基因沉默；②位置效应、DNA甲基化和异染色质化等导致转录水平内基因不表达[7]。RNAi是序列特异性的、天然的转录后基因沉默路径，广泛存在于真核生物内[8-10]。本研究采用RNA干扰技术将CrkⅡRNA干扰质粒转染至Hep-2细胞，而后采用Western blot和实时PCR检测CrkⅡRNA干扰质粒的干扰效率，结果显示，实验组Hep-2细胞中CrkⅡ在蛋白、mRNA水平上的表达水平均低于对照组，说明本研究采用CrkⅡ RNA干扰质粒将CrkⅡ基因成功敲除，使喉癌细胞株Hep-2中CrkⅡ的表达含量降低。

本研究中，MTT检测结果显示，实验组Hep-2细胞的细胞活力低于对照组，且随着时间的增长，实验组Hep-2细胞的细胞活力降低得更加明显，说明CrkⅡ表达下调抑制了Hep-2细胞的增殖能力。为了进一步将质粒和脂质体细胞毒性对细胞所产生的影响进行排除，本研究设立阴性对照组、空白对照组，结果显示，两个对照组细胞的增殖情况差异不明显，说明细胞生长不受质粒与脂质体细胞毒性的影响。划痕实验结果显示，实验组细胞的迁移率低于阴性对照组、空白对照组，说明CrkⅡ表达下调能够抑制Hep-2细胞的迁移能力。机体内的细胞迁移过程复杂，主要依赖于细胞外基质重塑、细胞与细胞外基质间附着变化、肌动蛋白细胞骨架协调重建和相关信号调节[11-13]。有研究显示，整合素信号对p130Cas-Crk-Dock180复合物刺激后可将Racl激活，对形成黏着斑、伪足延伸与肌肉蛋白骨架重塑起调节作用，从而发生细胞迁移[14-15]。所以，整合素信号传递受影响与Hep-2细胞内CrkⅡ表达下调后其迁移能力受限可能有关系。Transwell侵袭与迁移实验结果近似，说明CrkⅡ表达下调后，Hep-2细胞的侵袭能力也下降。研究显示，肿瘤转移、侵袭与CrkⅡ蛋白过表达有关，CrkⅡ蛋白过表达可造成肿瘤细胞出现上皮-间充质转化，CrkⅡ过表达可激活下游效应因子Rap、Rac1，加速细胞扩散，同时CrkⅡ可通过抑制β-连环蛋白与E-钙粘蛋白的聚集加速上皮黏附连接的分解，进而加速乳腺癌细胞的扩散[16]。同时，RNA干扰所介导的CrkⅡ基因沉默能够使CrkⅡ表达下调后抑制肿瘤细胞的生长、侵袭与迁移。

综上所述，喉癌细胞Hep-2中CrkⅡ的表达下调可明显降低细胞的侵袭、迁移和增殖能力，CrkⅡ蛋白有可能成为喉癌临床治疗中的新靶点。