乳腺癌缺氧诱导因子-1α、Ki-67表达与超声声像特征的关系

迪拉热·努尔太，热娜古力·阿不都热以木，依马木，张利

新疆维吾尔自治区人民医院1超声科，2普外科，乌鲁木齐 830001

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，随病情进展，患者的病死率和致残率明显上升[1]，且在部分高危人群中，乳腺癌的发病风险可持续上升[2]。乳腺癌的相关基础研究发现，细胞因子可以在肿瘤细胞生物学特征的改变过程中发挥重要作用。肿瘤相关蛋白的改变，可通过影响肿瘤细胞的浸润和黏附能力，导致肿瘤细胞增殖调控的异常，最终促进乳腺癌的发生发展。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表达水平升高，可通过改变肿瘤微环境，加剧肿瘤干细胞的异常增殖，促进乳腺癌的疾病进展[3]；Ki-67是增殖相关调控因子，可调控肿瘤细胞核的DNA，能够明显促进肿瘤细胞的持续异常分裂，增加肿瘤细胞的异常分化成熟的风险[4]。本研究旨在探讨Ki-67、HIF-1α的表达与乳腺癌患者超声声像特征的关系，从而进一步阐述乳腺癌的发生机制，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2018年9月新疆维吾尔自治区人民医院收治的乳腺癌患者。纳入标准：①均符合中华医学会制定的《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2015版）》中关于乳腺癌的诊断标准[5]，均经病理学检查证实为乳腺癌；②年龄≤65岁；③获取病理学标本前，患者未接受放化疗和免疫学治疗；④临床资料完整。排除标准：①合并精神疾病、免疫系统疾病；②合并肝肾功能损害的患者；③其他部位恶性肿瘤。依据纳入和排除标准，本研究共纳入110例女性乳腺癌患者，年龄35～65岁，平均年龄为（52.5±10.0）岁；肿瘤直径为（2.8±0.9）cm；TNM分期：Ⅰ期28例，Ⅱ期34例，Ⅲ期39例，Ⅳ期9例；分化程度：高分化31例，中分化49例，低分化30例。

1.2 检测方法

1.2.1 超声检测方法 采用Logic 906系列超声检测仪（美国GE公司）进行检测，探头为11 L，探头频率设置为6.5 MHz，观察乳腺癌患者的肿块大小、位置及边缘情况，重点观察毛刺征、肿块形态、钙化灶形态和血流显像分级，血流显像分级采用Adler分级模式，分为0～1级和2～3级。

1.2.2 免疫组化法检测Ki-67、HIF-1α蛋白的阳性表达率 取乳腺癌患者的乳腺癌组织，石蜡切片，二甲苯脱腊水化，5%的过氧化氢常温孵育10 min，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）孵育5 min，蒸馏水冲洗3次，每次5 min，5%的山羊血清抗体封闭10 min，不冲洗。滴加一抗（稀释浓度为1∶500），4℃冰箱孵育过夜，蒸馏水冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记好的二抗（稀释浓度为1∶1000），37℃孵育30 min，蒸馏水冲洗3次，每次5 min。滴加二代辣根酶标记的工作液，37℃孵育10 min，蒸馏水冲洗3次，每次5 min，显色后采用酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片，镜下观察。

1.2.3 免疫组化法检测结果判定 Ki-67蛋白主要定位于细胞质，HIF-1α蛋白主要定位在细胞核，当二者出现黄色、棕黄色、褐色颗粒时，说明为阳性表达。根据细胞的着色程度进行评分：无着色0分，淡黄色染色为1分，棕黄色染色为2分，褐色或黑色染色为3分。根据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例≤10%为1分，阳性细胞占比例为11%～50%为2分，阳性细胞所占比例为51%～75%为3分，阳性细胞所占比例＞75%为4分。将着色程度评分与阳性细胞所占比例评分相乘：＜3分为HIF-1α、Ki-67表达阴性，≥3分为HIF-1α、Ki-67表达阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对所有数据进行统计分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中Ki-67、HIF-1α蛋白的阳性表达情况

110例乳腺癌患者中，43例患者既存在Ki-67蛋白阳性表达又存在HIF-1α蛋白阳性表达，35例患者仅存在Ki-67蛋白阳性表达，13例患者仅存在HIF-1α蛋白阳性表达，Ki-67、HIF-1α蛋白阴性表达患者共19例。乳腺癌患者乳腺癌组织中Ki-67蛋白的阳性表达率为70.91%（78/110），HIF-1α蛋白的阳性表达率为50.91%（56/110）。

2.2 不同声像特征乳腺癌患者乳腺癌组织Ki-67、HIF-1α蛋白阳性表达率的比较

不同肿块直径、毛刺征情况乳腺癌患者乳腺癌组织中Ki-67蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同肿块形态、钙化灶形态、血流显像分级乳腺癌患者乳腺癌组织中Ki-67蛋白阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同肿块直径、毛刺征情况、肿块形态、钙化灶形态乳腺癌患者乳腺癌组织中HIF-1α蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同血流显像分级乳腺癌患者乳腺癌组织中HIF-1α蛋白阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同声像特征乳腺癌患者乳腺癌组织中Ki-67、HIF-1α蛋白的阳性表达情况

3 讨论

乳腺导管上皮细胞的持续性异常分裂或乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）基因的异常突变，均可明显促进乳腺癌的进展，合并乳腺癌家族史的人群，相关恶性肿瘤的发生风险可进一步上升[6]。乳腺癌患者的总体生存时间较短，治疗的总体病情缓解率较低，远期病死的风险仍然较高[7]。目前，临床缺乏对于乳腺癌患者影像学评估指标，虽然癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）或糖类抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）能够在乳腺癌的病情评估过程中发挥作用，但依靠CEA等指标评估乳腺癌患者影像学特征的灵敏度较低，其对乳腺癌超声影像特征评估的一致性不足40%[8]。本研究探讨HIF-1α、Ki-67的表达与乳腺癌患者超声影像特征的关系，进一步充实了乳腺癌患者影像学特征的检测灵敏度，从而能够进一步深入揭示乳腺癌的发生机制。

HIF-1α是缺氧诱导因子，可能够通过诱导肿瘤细胞的异常分裂，促进乳腺导管上皮细胞的异常增殖，最终促进乳腺癌的疾病进展。基础领域的研究也证实，HIF-1α表达上调还可改变乳腺癌肿瘤干细胞特征，导致肿瘤干细胞发生持续性自我增殖[9]。Ki-67是细胞核增殖相关抗原，可激活肿瘤细胞核上游转录基因，提高肿瘤细胞纺锤体或细胞器的合成和分裂速度。Ki-67还能够明显改变肿瘤细胞的生物学特征，从而改变肿瘤细胞的浸润和黏附能力，促进肿瘤细胞上皮-间充质转化[10-11]。目前的研究多探讨Ki-67的表达与乳腺癌的关系，结果发现，发生远处转移的乳腺癌患者Ki-67的表达水平明显升高[12]，但缺乏HIF-1α、Ki-67蛋白的表达与乳腺癌肿块性质或血流分级的关系研究。

本研究结果显示，不同肿块直径、毛刺征情况乳腺癌患者乳腺癌组织中Ki-67蛋白阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明毛刺样改变与Ki-67的表达无明显的关系。但不规则肿块、杆状钙化灶、3～4级血流显像分级的乳腺癌患者乳腺癌组织中Ki-67蛋白阳性表达率高于类圆形肿块、细沙状或颗粒状钙化灶、1～2级血流显像分级的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。表明Ki-67的表达与乳腺癌患者的超声影像特征密切相关，这主要由于Ki-67表达水平升高，可通过提高肿瘤细胞的增殖不规律性，增加了肿块形态的不规则性；且由于Ki-67对乳腺导管上皮细胞浸润的影响，导致了肿块中间肿瘤细胞的异常钙化，促进了钙化肿瘤细胞的黏附和杆状黏附作用，最终促进了杆状钙化灶的发生；而Ki-67阳性表达率较高的乳腺癌患者血流分级较高，这主要由于Ki-67表达水平升高，能够通过诱导新生血管内皮细胞生成，增加了肿瘤血流灌注的分支数量和血流量，从而导致血流分级的上升。刘淳等[13]研究结果显示，在具有明显的血流分级上升的乳腺癌患者中，Ki-67的表达阳性率明显上升，同时在肿块边缘不规则或具有明显不典型钙化灶的患者中，Ki-67的表达阳性率可持续上升。本研究结果显示，3～4级血流显像分级乳腺癌患者乳腺癌组织中HIF-1α的阳性表达率高于1～2级血流显像分级的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。这主要是因为HIF-1α诱导的缺氧环境，能够明显促进肿瘤新生血管生成和肿瘤血管的重塑性改变，最终促进血流分级的上升[14-15]。本研究并未发现HIF-1α的表达与肿块形态或钙化灶特征的关系，表明HIF-1α的表达与乳腺癌患者的一般性肿块特征并无明确的关系。

综上所述，乳腺癌患者乳腺癌组织中HIF-1α的表达可能与血流显像分级有关，Ki-67的表达可能与肿块形态、钙化灶形态及血流显像分级有关。